一：雙向電泳法

原理：雙向電泳一次可以從細胞、組織或其它生物樣本中分離上千種蛋白質(zhì)，凝膠上的斑點都對應(yīng)著樣品中的蛋白質(zhì)，且各種蛋白質(zhì)的等電點，分子量和含量的信息都能通過質(zhì)譜鑒定和軟件分析獲得。因此其在蛋白質(zhì)組分析、疾病標志物檢測、細胞差異分析、藥物開發(fā)、癌癥研究等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。

優(yōu)點：

（1）經(jīng)典方法、應(yīng)用范圍廣、適用于各類材料；

（2）經(jīng)濟實惠，可大規(guī)模多個樣本篩選和分析。

二：雙向熒光差異凝膠電泳（DIGE）法

原理：DIGE — 雙向熒光差異凝膠電泳，利用熒光染料（Cy2, Cy3, Cy5）能與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基反應(yīng)而使蛋白質(zhì)被標記，標記后蛋白質(zhì)的等電點和分子量基本不受影響，等量混合標記好的蛋白質(zhì)后進行雙向電泳，蛋白質(zhì)表達量的變化則通過不同熒光的強度來體現(xiàn)。

優(yōu)點：

（1）高效性，同一塊凝膠上可以電泳兩個樣品，減輕了工作量；

（2）與常規(guī)銀染相比靈敏度更高；

（3）檢測動態(tài)范圍更大；

（4）定量精確, 采用內(nèi)標而消除了膠與膠之間的實驗誤差；

（5）統(tǒng)計學分析，ImageMaster7.0（DIGE）軟件可以得到統(tǒng)計學可信的結(jié)果，降低了操作者之間的偏差。

三：化學標記法—iTRAQ定量方法

原理：iTRAQ試劑是可與氨基酸末端氨基及賴氨酸側(cè)鏈氨基連接的胺標記同重元素。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。 在串聯(lián)質(zhì)譜中，信號離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(113-119，121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以鑒定出蛋白質(zhì)和分析出同一蛋白質(zhì)不同處理的定量信息。

優(yōu)點：

（1）靈敏度高，檢測限低，可檢測出低豐度蛋白；

（2）分離能力強,分析范圍廣,iTRAQ可以對任何類型的蛋白質(zhì)進行鑒定，包括高分子量蛋白質(zhì)、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋 白；

（3）高通量：同時對8個樣本進行分析，提高了實驗通量，可同時對多個時間點或不同處理的蛋白質(zhì)進行分析；

（4）結(jié)果可靠：定性與定量分析結(jié)果更加可靠；

（5）自動化程度高：液相與質(zhì)譜連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。

四：化學標記法—ICAT法

原理：ICAT試劑結(jié)構(gòu)，包括3個部分，SH反應(yīng)集團， biotin標簽，同位素臂，試劑具有兩種形式：重型（含8個氘）和輕型（不含氘），來源不同處理的蛋白質(zhì)分別用重型ICAT試劑和輕型ICAT試劑標記，標記后等量混合，胰蛋白酶酶切，親和純化得到ICAT標記的多肽，質(zhì)譜分析，依據(jù)MS質(zhì)譜峰圖強度進行定量，MS/MS鑒定肽段。

優(yōu)點：

（1）它不能用于標記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質(zhì)；

（2）ICAT分子量相對較大（約500Da），與蛋白質(zhì)連接后可能會造成分子的空間位阻；

（3）ICAT分子量相對較大（約500Da），由于在MS分析中標簽仍保留在每個肽上，使得在碰撞誘導解吸（CID)條件下，很容易被片段化，那么標簽特異化的片段離子就會使串聯(lián)質(zhì)譜分析標記肽段的過程復(fù)雜化；

（4）ICAT分子量相對較大（約500Da），這對小肽而言是一個較大的修飾物，會增加數(shù)據(jù)庫搜索的復(fù)雜性；

（5）標記時通常需要延長時間來保證ICAT與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，這可能會造成賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸發(fā)生氨基酸局部衍化。

五：代謝標記法—15N標記法

原理：在培養(yǎng)基中添加15N，細胞經(jīng)過若干代培養(yǎng)后，蛋白質(zhì)將完全被同位素標記，等量混合標記與沒有標記同位素的樣本、液相色譜和SDS-PAGE分離，質(zhì)譜鑒定和定量。根據(jù)質(zhì)譜譜圖中成對峰的面積之比可判斷出同一肽段在不同樣品中的含量變化，根據(jù)二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質(zhì)。

優(yōu)點：

（1）高效性：15N標記法是體內(nèi)標記技術(shù)，標記效率可高達95%；

（2）重現(xiàn)性：降低由于樣品制備不同而造成的實驗內(nèi)差異；

（3）靈活性：在培養(yǎng)基中添加同位素標記15N ，操作方便。

六：代謝標記法—SILAC法

原理：SILAC即細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術(shù)(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，其基本原理是在細胞培養(yǎng)時，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，用于SILAC主要的穩(wěn)定同位素氨基酸是Lys和Arg, 細胞在傳代培養(yǎng)過程中同位素氨基酸將被細胞用于合成蛋白質(zhì)，細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)5-6代后，細胞的所有蛋白質(zhì)將被同位素標記，等量混合標記的蛋白質(zhì)后經(jīng)過SDS-PAGE分離和質(zhì)譜分析，通過比較一級質(zhì)譜圖中三個同位素型肽段的面積大小進行相對定量，同時二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質(zhì)。

優(yōu)點：

（1）高效性：SILAC是體內(nèi)標記技術(shù)，標記效率可高達100%；

（2）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實驗內(nèi)差異；

（3）高通量、靈敏度高：可同時鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質(zhì)，且檢可測測到納克級水平；

（4）相容性：可以對多種在DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細胞或細菌中表達的蛋白進行標記；

（5）靈活性：在缺乏L-賴氨酸和L-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同位素標記的這兩種氨基酸，操作方便。