ChIP染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)簡介
ChIP(chromatin immunoprecipitation assay, 染色質(zhì)免疫共沉淀)是研究體內(nèi)DNA與蛋白結(jié)合的重要技術(shù),主要包括ChIP-qPCR和ChIP-seq兩種;其中ChIP-qPCR用來驗(yàn)證與目標(biāo)蛋白結(jié)合的已知DNA片段,ChIP-seq用來篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的未知DNA片段。
先用甲醛交聯(lián)細(xì)胞內(nèi)“蛋白-DNA”復(fù)合物,并用超聲波破碎DNA至適合的長度。細(xì)胞裂解后,孵育結(jié)合了抗體的珠子,誘餌蛋白通過其抗體便結(jié)合到了Beads上,同時(shí)和誘餌蛋白互作的DNA,也一起沉淀到Beads上。洗滌掉未結(jié)合的DNA后,再用洗脫液將DNA-蛋白復(fù)合物從Beads洗脫下來,便得到染色質(zhì)免疫共沉淀產(chǎn)物。DNA-蛋白復(fù)合物去交聯(lián)后,既可qPCR檢測已知DNA片段,也可用二代測序與蛋白互作的DNA片段。
當(dāng)沒有合適的誘餌蛋白抗體時(shí),可以通過表達(dá)融合了flag標(biāo)簽的誘餌蛋白,利用flag標(biāo)簽做免疫沉淀。即細(xì)胞過表達(dá)Flag-Bait,經(jīng)裂解后與anti-Flag珠子孵育,誘餌融合蛋白與Beads結(jié)合,與誘餌融合蛋白互作的DNA“共沉淀”到Beads上,再經(jīng)洗滌、洗脫后做qPCR或NGS測序。
輝駿生物10年科研服務(wù)經(jīng)驗(yàn),專業(yè)提供分子互作實(shí)驗(yàn)服務(wù),包括蛋白與蛋白、蛋白與DNA、蛋白與RNA、RNA與RNA的相互作用技術(shù),經(jīng)驗(yàn)豐富,實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、可靠。
我公司自有分子、細(xì)胞和蛋白實(shí)驗(yàn)平臺(tái),能執(zhí)行最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)路線。
我們不僅會(huì)提供專業(yè)的售前方案建議、而且售后技術(shù)支持將一直保持到文章發(fā)表,確保您安心進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)及投稿。
目前,客戶已在Nature子刊、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發(fā)表大量高分文章(點(diǎn)擊查看客戶文獻(xiàn))。
◆ 基因表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜、調(diào)控有序的過程,DNA與蛋白質(zhì)的相互作用是基因轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控的關(guān)鍵,研究它們的相互作用是研究染色質(zhì)上基因表達(dá)調(diào)控的重要領(lǐng)域。
◆ chip(染色質(zhì)免疫共沉淀)是檢測體內(nèi)條件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法,該技術(shù)由 Orlando等于1997年創(chuàng)立,目前已廣泛應(yīng)用于組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子作用位點(diǎn)和DNA甲基化等研究中。
◆ 轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子,是指能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用來激活或抑制基因表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白。轉(zhuǎn)錄因子有4個(gè)主要結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合域決定了轉(zhuǎn)錄因子的特異性,轉(zhuǎn)錄調(diào)控域(包括激活域或抑制域)決定了轉(zhuǎn)錄因子的功能,寡聚化位點(diǎn)使不同轉(zhuǎn)錄因子間發(fā)生相互作用,核定位信號(hào)控制轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核。
◆ 組蛋白是染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)——核小體中的重要組成部分,其N-端尾部暴露在核小體的表面,可發(fā)生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚 ADP 糖基化等共價(jià)修飾,影響組蛋白與DNA的親和性,改變?nèi)旧|(zhì)的疏松或凝集狀態(tài),或影響其它轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子的親和性,激活或抑制基因表達(dá)。
◆ DNA甲基化是在不改變DNA序列的前提下,由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基轉(zhuǎn)移到DNA上,其中發(fā)生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化(5-mC)是DNA甲基化的主要形式。甲基的引入使DNA分子空間結(jié)構(gòu)改變,DNA大溝無法與DNA結(jié)合蛋白(轉(zhuǎn)錄因子、拓?fù)洚悩?gòu)酶、RNA聚合酶、阻抑蛋白等)正常結(jié)合,導(dǎo)致某些基因轉(zhuǎn)錄失活。因此,DNA甲基化通常抑制基因表達(dá),去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。
服務(wù)項(xiàng)目 | 服務(wù)內(nèi)容 | 結(jié)果交付 | 實(shí)驗(yàn)周期 | 客戶提供 | 價(jià)格 |
ChIP qPCR | Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 | 4-5周 | 實(shí)驗(yàn)樣本 誘餌蛋白的IP級(jí)抗體 實(shí)驗(yàn)信息表 | |
ChIP調(diào)取誘餌蛋白及其結(jié)合的DNA片段 (2組:實(shí)驗(yàn)組和對照組) | 誘餌蛋白的Western blot檢測圖 待測DNA序列的qPCR檢測數(shù)據(jù) ChIP實(shí)驗(yàn)報(bào)告 | ||||
ChIP seq | Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 | 4-5周 | 實(shí)驗(yàn)樣本 誘餌蛋白的IP級(jí)抗體 實(shí)驗(yàn)信息表 | |
ChIP調(diào)取誘餌蛋白及其結(jié)合的DNA片段 (2組:實(shí)驗(yàn)組和對照組) | 誘餌蛋白的Western blot檢測圖 ChIP實(shí)驗(yàn)報(bào)告 | ||||
Seq檢測ChIP產(chǎn)物中的DNA片段并分析 (2組:input組和實(shí)驗(yàn)組) | Seq檢測結(jié)果 檢測和分析報(bào)告 | 9周 |
樣本類型 | ChIP qPCR 建議送樣量 | ChIP seq 建議送樣量 |
動(dòng)物細(xì)胞 | 3*10e7個(gè)細(xì)胞/組(約3個(gè)10cm皿) | 5*10e7個(gè)細(xì)胞/組(約5個(gè)10cm皿) |
▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實(shí)驗(yàn)和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細(xì)送樣指南可聯(lián)系輝駿生物客服或銷售索取。
保存及運(yùn)輸:-80℃保存,干冰取樣/運(yùn)輸,至少在送樣前2天通知我司。
Zhuang Q. et al: NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming.
Nature Cell Biology. 2018. (IF=28.824)
Ncor1(編碼NCoR)和Ncor2(編碼SMRT)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、胚胎干細(xì)胞(ESC)和OSKM重編程細(xì)胞中均有表達(dá),無論用怎樣的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法、報(bào)告系統(tǒng)、MEF類型或培養(yǎng)基,抑制Ncor1/2的表達(dá)都能增強(qiáng)OSKM誘導(dǎo)的重編程,這是因?yàn)?span style="font-family: 微軟雅黑, " microsoft="" font-size:="" text-align:="">NCoR/SMRT–HDAC3共抑制復(fù)合物通過與OSKM因子(尤其是c-MYC)相互作用為重編程制造障礙,這一發(fā)現(xiàn)揭示了c-MYC在重編程中的雙重作用,也有助于解釋為何用OSKM而非OSK誘導(dǎo)重編程更容易產(chǎn)生pre-iPSCs,以及為何用HDAC抑制劑對OSKM而非OSK誘導(dǎo)的重編程能產(chǎn)生更強(qiáng)的效果等問題。
? 人cDNA克隆庫
? 慢病毒干擾載體
? 抗體從頭測序
? COIP 試劑盒
? Flag 試劑盒
1. ChIP qPCR,用于檢測某樣本中的誘餌蛋白和待測DNA片段是否結(jié)合;
2. ChIP seq,用于篩選某樣本中的誘餌蛋白可以結(jié)合哪些DNA區(qū)域。
ChIP(染色質(zhì)免疫共沉淀)檢測服務(wù) | |||||
服務(wù)項(xiàng)目 | 服務(wù)內(nèi)容 | 結(jié)果交付 | 實(shí)驗(yàn)周期 | 客戶提供 | 價(jià)格 |
ChIP qPCR | Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 | 5-6周 | 實(shí)驗(yàn)樣本 誘餌蛋白的IP級(jí)抗體 實(shí)驗(yàn)信息表(樣本信息,誘餌蛋白及待測DNA序列) | |
ChIP調(diào)取誘餌蛋白及其結(jié)合的DNA片段 (2組:實(shí)驗(yàn)組和對照組) | ChIP實(shí)驗(yàn)報(bào)告 | ||||
Western blot檢測ChIP產(chǎn)物中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 | ||||
qPCR檢測ChIP產(chǎn)物中的待測DNA片段 | qPCR檢測數(shù)據(jù) | ||||
ChIP seq | Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 | 5-6周 | 實(shí)驗(yàn)樣本 誘餌蛋白的IP級(jí)抗體 實(shí)驗(yàn)信息表(樣本信息,誘餌蛋白序列) | |
ChIP調(diào)取誘餌蛋白及其結(jié)合的DNA片段 (2組:實(shí)驗(yàn)組和對照組) | ChIP實(shí)驗(yàn)報(bào)告 | ||||
Western blot檢測ChIP產(chǎn)物中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 | ||||
seq檢測ChIP產(chǎn)物中的DNA片段并分析 | seq檢測結(jié)果、檢測和分析報(bào)告 | 9周 |
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近十年服務(wù)經(jīng)驗(yàn),服務(wù)案例眾多,客戶發(fā)文Nature Cell Biology等高質(zhì)量期刊
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可對圍繞DNA結(jié)合蛋白開展的整體課題提供全方位方案建議
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自有分子及細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)平臺(tái),能有效制定并執(zhí)行最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)路線
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售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章,確??蛻舭残倪M(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)及投稿
樣本類型 | ChIP-qPCR建議送樣量 | ChIP-seq建議送樣量 |
動(dòng)物細(xì)胞 | 3*10e7個(gè)細(xì)胞/組(約3個(gè)10cm皿) | 5*10e7個(gè)細(xì)胞/組(約5個(gè)10cm皿) |
▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實(shí)驗(yàn)和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細(xì)送樣指南可聯(lián)系輝駿生物客服或銷售索取。
(1)客戶收集細(xì)胞前需要先進(jìn)行甲醛交聯(lián),之后收集細(xì)胞沉淀,用PBS清洗干凈后,離心去掉液體,先放入液氮中速凍,再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存;廣州市內(nèi)的客戶也可以提供活細(xì)胞(常溫運(yùn)輸,如果冬天溫度較低可以用37℃復(fù)溫的冰袋保存),我方交聯(lián);
(2)樣本一定要做好標(biāo)記,應(yīng)用油性防凍記號(hào)筆或標(biāo)簽紙?jiān)诠苌献⒚鳂颖久Q或編號(hào);
(3)樣本較多或需要分批做,要將樣本分裝;
(4)干冰取樣/運(yùn)輸;需要至少在送樣前一天通知我方。
ChIP qPCR檢測數(shù)據(jù)
ChIP組相對于input組的富集圖(% input)
ChIP組相對于IgG組的富集圖
1.Zhuang Q. et al: NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming. Nature Cell Biology.2018,IF=17.728. |
2.Wang R.H. et al: A requirement for breast-cancer-associated gene 1(BRCA1) in the spindle checkpoint. PANS. 2004,IF=9.58. |
4899+客戶已添加微信獲取實(shí)驗(yàn)優(yōu)惠!
貨號(hào) | 規(guī)格 | 貨期 | 價(jià)格 |
ChIP試劑盒(Protein G 樹脂) | FI8902 | 現(xiàn)貨 | |
ChIP試劑盒(Protein A/G 磁珠) | FI8903 | 現(xiàn)貨 | |
ChainFreeTM FLAG-Tag ChIP試劑盒 | FI8904 | 現(xiàn)貨 | |
ChainFreeTM GFP-Tag ChIP試劑盒 | FI8907 | 現(xiàn)貨 | |
ChainFreeTM mCherry-Tag ChIP試劑盒 | FI8908 | 現(xiàn)貨 |
染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP是研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合的技術(shù)。先用甲醛交聯(lián)細(xì)胞內(nèi)的“蛋白-DNA”復(fù)合物,裂解細(xì)胞后,用超聲波破碎DNA至適合的長度,采用特異性抗體捕獲細(xì)胞內(nèi)的誘餌蛋白及其結(jié)合的DNA片段,再加入protein G樹脂沉淀“抗體-誘餌蛋白-結(jié)合DNA” 復(fù)合體,隨后將蛋白與DNA解交聯(lián),提取結(jié)合的DNA。該DNA可用于后續(xù)的定量PCR檢測(qPCR)或高通量測序(seq)。
基因表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜、調(diào)控有序的過程,DNA與蛋白質(zhì)的相互作用是基因轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控的關(guān)鍵。ChIP(染色質(zhì)免疫共沉淀)是檢測體內(nèi)條件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法,用于驗(yàn)證或?qū)ふ遗c已知蛋白結(jié)合的DNA序列。以下列舉了可應(yīng)用ChIP試劑盒的幾個(gè)研究方向:
試劑名稱 | 體積(12 Tests) | 體積(24 Tests) | 保存條件 |
Protein G或Protein A/G beads | 500 μL | 1 mL | 4 ℃,1年 |
裂解緩沖液 | 7 mL | 14 mL | 4 ℃,1年 |
漂洗液 | 25 mL | 50 mL | 4 ℃,1年 |
洗脫緩沖液 | 400 μL | 800 μL | 4 ℃,1年 |
10xTE緩沖液 | 550 μL | 1.1 mL | 4 ℃,1年 |
NaCl | 260 μL | 520 μL | 4 ℃,1年 |
Proteinase K | 130 μL | 260 μL | -20 ℃,1年 |
RNaseA | 130 μL | 260 μL | -20 ℃,1年 |
蛋白酶抑制劑 | 190 μL | 380 μL | -20 ℃,1年 |
ChIP試劑盒—輝駿生物產(chǎn)品優(yōu)勢
2. 操作簡便,周期短,適合初學(xué)者。
3. 品質(zhì)好,實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。
4. 適配后續(xù)qPCR和高通量測序?qū)嶒?yàn)。
實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo):檢測誘餌蛋白(A)和待測DNA序列(B)的結(jié)合。
圖一:誘餌蛋白的western-blot檢測圖
Normalized to Input | B基因-引物1 | B基因-引物2 |
---|---|---|
Input | 1 | 1 |
IgG_ChIP | 0.01% | 0.01% |
Anti-A_ChIP | 0.44% | 0.23% |
Normalized to IgG | B基因-引物1 | B基因-引物2 |
IgG_ChIP | 1 | 1 |
Anti-A_ChIP | 59.19 | 50.80 |
ChIP-qPCR結(jié)果統(tǒng)計(jì)表
圖二:ChIP-qPCR結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖
試劑名稱 | 體積(12 Tests) | 體積(24 Tests) | 保存條件 |
ChainFreeTM 標(biāo)簽抗體磁珠 | 250 μL | 500 μL | 4 ℃,1年 |
裂解緩沖液 | 7 mL | 14 mL | 4 ℃,1年 |
漂洗液 | 25 mL | 50 mL | 4 ℃,1年 |
洗脫緩沖液 | 400 μL | 800 μL | 4 ℃,1年 |
10xTE緩沖液 | 550 μL | 1.1 mL | 4 ℃,1年 |
NaCl | 260 μL | 520 μL | 4 ℃,1年 |
Proteinase K | 130 μL | 260 μL | -20 ℃,1年 |
RNaseA | 130 μL | 260 μL | -20 ℃,1年 |
蛋白酶抑制劑 | 190 μL | 380 μL | -20 ℃,1年 |
ChainFreeTM系列ChIP試劑盒-輝駿生物產(chǎn)品優(yōu)勢
1、無抗體輕重鏈污染:IP復(fù)合物無論采用非變性洗脫還是變性洗脫,均不會(huì)出現(xiàn)抗體的輕、重鏈污染問題。
2、親和力強(qiáng):低nM級(jí)別親和力,輕松應(yīng)對低拷貝基因,或難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
3、特異性強(qiáng):抗體磁珠通過了20株以上的空白細(xì)胞系檢測,不易產(chǎn)生非特異吸附。
4、結(jié)合量高:每10 μL抗體磁珠可結(jié)合約15 μg重組蛋白。
DNA或者RNA片段化后,在進(jìn)行免疫沉淀前,需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對照(不進(jìn)行免疫沉淀過程)。Input是斷裂后的基因組DNA或者RNA,需要與沉淀后的樣品DNA/RNA一起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián),DNA/RNA純化,以及最后的PCR或其他方法檢測。通過后續(xù)數(shù)據(jù)分析,我們可以通過Input對照排除背景噪音(排除因本底表達(dá)水平高或一些非特異性結(jié)合所造成的假陽性peaks),驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果和整個(gè)實(shí)驗(yàn)中IP效果,所以Input對照是IP-seq實(shí)驗(yàn)必不可少的步驟。
物種為2倍體,基因拼接至染色體水平(NCBI),注釋完整(GTF文件)即可。其他物種需要實(shí)驗(yàn),可咨詢輝駿生物技術(shù)熱線:400-699-1663
Input和IP屬于兩個(gè)樣本,在前期檢測、建庫、測序都是平行進(jìn)行的,但是分析中需要將兩個(gè)樣本的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析,得出最終的peak結(jié)果,并進(jìn)行后續(xù)分析。
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