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服務(wù)介紹應(yīng)用案例常見問答

 LC-MS/MS蛋白鑒定 * 技術(shù)原理


質(zhì)譜是將待測物質(zhì)變?yōu)闅鈶B(tài)離子并將離子按質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)行分離和分析的一種方法。蛋白先經(jīng)胰蛋白酶消化成肽段,肽段在質(zhì)譜儀中離子化后,會(huì)帶上一定量的電荷,通過檢測器分析,可得到各肽段的質(zhì)荷比(m/z),即一級質(zhì)譜圖;為獲得肽段更詳細(xì)的序列信息,部分肽段再次被破碎和分析,產(chǎn)生二級質(zhì)譜圖。最后采用質(zhì)譜檢索軟件選擇相應(yīng)的蛋白數(shù)據(jù)庫,對獲得的全部質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,同時(shí)以打分的形式將鑒定到的蛋白依次排列,得到樣本中蛋白的定性結(jié)果。




LC-MS/MS蛋白鑒定 * 實(shí)驗(yàn)流程



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LC-MS/MS蛋白鑒定 * 應(yīng)用范圍


可以檢測各種類型的蛋白樣本,例如蛋白溶液、干粉、膠條或斑點(diǎn)等,一次上機(jī)可以檢測到高達(dá)1000多種蛋白質(zhì)。以下列舉了可能應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜(LC-MS/MS)的幾個(gè)方向:

1.  IP,Co-IP,Pull-down類蛋白相互作用樣本(膠條或溶液)的鑒定;

2. 細(xì)胞器,外泌體等簡單樣本的蛋白質(zhì)表達(dá)譜鑒定(全譜分析)。


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LC-MS/MS蛋白鑒定 * 服務(wù)信息


項(xiàng)目名稱

客戶提供

結(jié)果交付

實(shí)驗(yàn)周期

價(jià)格

LC-MS/MS蛋白鑒定

蛋白溶液(干冰運(yùn)輸)

蛋白膠條/膠點(diǎn)(冰袋運(yùn)輸)

廣州地區(qū)可上門取樣

樣本信息表

蛋白及肽段鑒定結(jié)果表

質(zhì)譜檢索網(wǎng)頁

指定肽段的質(zhì)譜圖

質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)報(bào)告

2周

點(diǎn)擊詢價(jià)







LC-MS/MS蛋白鑒定 * 服務(wù)優(yōu)勢



輝駿生物旨在為客戶提供良好的質(zhì)譜鑒定服務(wù),客戶可以進(jìn)行幾乎所有感興趣的研究,如蛋白質(zhì)組分析、小分子的高分辨率分析、復(fù)雜環(huán)境中小分子的定量分析等。

1
近十年服務(wù)經(jīng)驗(yàn),眾多服務(wù)案例,服務(wù)成果得到優(yōu)秀期刊認(rèn)可
2
自有互作實(shí)驗(yàn)平臺(tái),對IP、pull down等微量蛋白的鑒定有十足把控力
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可以提供實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣品制備、質(zhì)量控制、質(zhì)譜處理、生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析等全套服務(wù)內(nèi)容
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質(zhì)譜儀器先進(jìn),操作人員技術(shù)成熟,鑒定準(zhǔn)確度和靈敏度高
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售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章,確??蛻舭残倪M(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)及投稿





LC-MS/MS蛋白鑒定 * 客戶文獻(xiàn)


1. UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. (2020 , IF=10.717).

2. Gao C.J. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants, 5(5):512-524 (2019,IF=19.40).

3. Tang W.W. et al: The p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2 signalling axis regulates cell proliferation in human colorectal cancer. Nature Communications (2019,IF = 12.121).

4. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods, 15(3): 213–220 (2018,IF=28.467).




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輝駿實(shí)力

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中文標(biāo)題:捕獲新轉(zhuǎn)錄RNA的相互作用體,或促進(jìn)對不同細(xì)胞和系統(tǒng)中總RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組的深入研究

發(fā)表期刊:Nature Methods

影響因子:28.467

合作單位:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)學(xué)與健康研究所

運(yùn)用技術(shù):LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定(由輝駿生物提供技術(shù)支持)



● 研究背景


目前系統(tǒng)研究RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組的方法主要是基于捕獲多聚腺苷酸(PolyA)RNA,主要是帶有寡聚(DT)包被珠的mRNA。然而PolyA尾巴只在新轉(zhuǎn)錄的RNA成熟的過程中被添加到RNA中,而一些成熟的mRNA要么是非PolyA的,要么是雙態(tài)的。此外,成熟的非PolyA RNA物種占所有轉(zhuǎn)錄序列的很大一部分。捕獲與所有類型RNA相互作用的RNA結(jié)合蛋白的方法不僅可以擴(kuò)大我們目前對RNA相互作用組的看法,而且有助于理解非Polya RNA在生理和疾病中的功能。




● 研究結(jié)果


1. 利用RICK技術(shù)捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA互作組


研究者用Eu標(biāo)記HeLa細(xì)胞中的RNA,固定細(xì)胞后通過點(diǎn)擊反應(yīng)使Eu生物素化,然后用鏈霉親和素包裹的珠子提取RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。凝膠電泳和銀染證實(shí)Rick方法成功分離出與EU標(biāo)記RNA直接相互作用的蛋白質(zhì)。Western blotting驗(yàn)證了Rick對已知RNA相關(guān)蛋白的捕獲。

LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定-客戶文獻(xiàn)-輝駿生物.png

  圖1



2. Rick捕獲的RNA種類


研究者對Rick pull down樣本進(jìn)行了RNA測序(RNA-seq),分析結(jié)果(圖2A)與Castello的oligo(DT)捕獲數(shù)據(jù)相比顯示出明顯的差異,在該數(shù)據(jù)中,捕獲的RNA中80%是mRNA。接下來,研究者研究了Rick樣本中的富集與三種相關(guān)的非PolyA RNA:CircRNA、近端啟動(dòng)子RNA(ppRNA)和增強(qiáng)子RNA(ERNA)的oligo(Dt)捕獲情況。在對ppRNA的評估中,與oligo(Dt)捕獲相比,Rick樣本中轉(zhuǎn)錄暫?;?TR>4)在TSS周圍積累了更高的RNA-seq信號,這表明僅通過Rick就能有效地分離ppRNA;而非暫?;?TR<4)差異則很小(圖2B,C)。此外,在Rick樣本中,RNA-seq信號在假定的增強(qiáng)子區(qū)域16(6.05%)上有很強(qiáng)的富集,而在寡核苷酸(DT)捕獲中幾乎沒有(0.11%)(圖2D)。RT-qPCR進(jìn)一步證實(shí),與oligo(Dt)捕獲相比,用Rick提取的非Polya RNA分離效果良好。簡言之,除Polya RNA外,Rick還成功地分離出了其他各種RNA種類,表明它也可以富集不是通過寡核苷酸(DT)捕獲方法分離的相關(guān)結(jié)合蛋白。

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圖2



3. RICK法分離蛋白質(zhì)的特性研究


采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對Rick分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。與oligo(DT)捕獲在不同條件下的比較表明,Rick分離了許多在oligo(DT)捕獲研究中沒有鑒定到的蛋白質(zhì))(圖3B),這些差異既不是由于細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白質(zhì)組學(xué)程序的差異,也不是由Eu標(biāo)記引起的(圖3A)。


LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定-客戶文獻(xiàn)-輝駿生物.png

圖3

 


4. RICK分離蛋白的功能分析


對295個(gè)RICK特有的RBP進(jìn)行了GO分析,觀察了與有絲分裂相關(guān)的生物過程的富集(圖4A)。KEGG途徑分析還將“細(xì)胞周期”列為前十個(gè)最顯著富集的途徑(圖4B)。相反,對Rick鑒定的425種蛋白質(zhì)進(jìn)行的GO和KEGG分析顯示,oligo(dT)捕獲數(shù)據(jù)集中存在的蛋白質(zhì)主要與RNA相關(guān)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步加強(qiáng)了Rick在分離用寡核苷酸(DT)捕獲方法未鑒定出的蛋白質(zhì)方面的獨(dú)特性,并揭示了RNA在意想不到的細(xì)胞過程中的功能。

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圖4


 

5. RICK識別與非polyA RNA優(yōu)先結(jié)合的蛋白質(zhì)


考慮到通過Rick和oligo(DT)捕獲分離的RNA種類的顯著差異,295個(gè)RICK特有的RBP中有相當(dāng)一部分可能優(yōu)先與非polyA RNA結(jié)合。這種特異性可能是由于化學(xué)計(jì)量學(xué)、亞細(xì)胞定位或潛在的內(nèi)在結(jié)合特異性。LC-MS/MS鑒定出914個(gè)高置信度蛋白質(zhì),稱之為“PolyA缺失型Rick蛋白”。在這914個(gè)蛋白質(zhì)中,576個(gè)與標(biāo)準(zhǔn)Rick程序的720個(gè)高置信度蛋白質(zhì)重疊(圖5A)。進(jìn)一步分析表明,295個(gè)RICK特有的RBP中有204個(gè)(69.2%)與914個(gè)PolyA缺失型Rick蛋白重疊(圖5B)。此外,在710個(gè)與RICK特有RBP不重疊的710個(gè)polyA缺失型RICK蛋白中,有563個(gè)出現(xiàn)在oligo(DT)捕獲數(shù)據(jù)集中(圖5B),這表明這些蛋白具有結(jié)合PolyA和非PolyA RNA的混合趨勢。這些結(jié)果表明,Rick可用于鑒定優(yōu)先與非Polya RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。


LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定-客戶文獻(xiàn)-輝駿生物.png

圖5

 


6. 與METTL1和CDK1相互作用的RNA特性 


我們選擇了兩個(gè)Rick特有的RBP METTL1和CDK1,用PAR-CLIP測序方法研究了它們相互作用的RNA。METTL1的兩個(gè)獨(dú)立PAR-CLIP測序?qū)嶒?yàn)顯示捕獲的RNA存在廣泛重疊,其中很大一部分也被RICK捕獲。進(jìn)一步分析證實(shí)METTL1與tRNA顯著結(jié)合,還與多種推測為非polyA的RNA結(jié)合,如內(nèi)含子RNA和從基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄的RNA(圖5C)。接下來,研究者使用隨機(jī)六聚體或寡聚體(dT)引物進(jìn)行RNA免疫沉淀(RIP),然后進(jìn)行RT-qPCR,以識別METTL1靶RNA是否具有polyA尾巴。RIP-qPCR顯示,使用隨機(jī)六聚體富集了7個(gè)mRNA,而使用寡聚(DT)引物只能擴(kuò)增出其中的3個(gè),證實(shí)了METTL1與含有mRNA序列的非PolyA RNA結(jié)合(圖5D)。CDK1 PAR-CLIP測序分析顯示與轉(zhuǎn)錄自基因間區(qū)域和內(nèi)含子RNA的RNA結(jié)合,與RICK捕獲的RNA也存在廣泛重疊。后續(xù)分析進(jìn)一步表明,METTL1和CDK1廣泛地與非PolyA RNA結(jié)合,暗示這兩種蛋白的RNA相關(guān)功能被忽視。

 



7. 利用RICK捕獲新生RNA互作組


研究者對HeLa細(xì)胞進(jìn)行了短Eu標(biāo)記(0.5、1和2小時(shí)),以研究Rick是否可以捕獲與新生RNA互作的蛋白。鑒定了208種不同的高置信度蛋白質(zhì)(分別為149、119和143,作用時(shí)間分別為0.5、1和2小時(shí)),稱之為“新生富集RBP”和319種低置信度蛋白質(zhì)(圖6A)。對208個(gè)新生富集RBP進(jìn)行的GO和KEGG通路分析顯示,轉(zhuǎn)錄和RNA代謝相關(guān)術(shù)語顯著豐富(圖6B)。進(jìn)一步的研究表明,新生RNA轉(zhuǎn)錄和局部代謝物產(chǎn)生之間存在聯(lián)系,從而調(diào)節(jié)表觀基因和潛在的表觀轉(zhuǎn)錄基因。

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圖6

 


8. 利用RICK獲取mESC總RNA互作組


為證明Rick可以應(yīng)用于其他類型的細(xì)胞,研究者用鏈霉親和素結(jié)合辣根過氧化物酶證實(shí)了Eu在mESC中的有效摻入,并進(jìn)行了LC-MS/MS,鑒定出518個(gè)高置信蛋白和304個(gè)低置信蛋白。這518個(gè)高置信度蛋白質(zhì)中有160個(gè)與Kwon等人報(bào)告的“mESC mRNA相互作用組”重疊,而358個(gè)是RICK獨(dú)有的,因此將其稱為RICK獨(dú)有的mESC RBP。對這358個(gè)候選限制性商業(yè)慣例的GO分析顯示,RNA結(jié)合或PolyA RNA結(jié)合術(shù)語豐富。在這358個(gè)蛋白中,有95個(gè)在mESC中的表達(dá)水平高于分化后的細(xì)胞,這表明mESC在自我更新或多能性方面具有潛在的作用。因此,Rick可以應(yīng)用于HeLa以外的不同細(xì)胞類型;此外還需要進(jìn)一步的研究來確定新發(fā)現(xiàn)的候選RBP在mESC自我更新/多能性中的作用。


輝駿生物實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)商,10年專注科研實(shí)驗(yàn),專業(yè)提供全方位蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白/核酸互作、代謝組學(xué)、分子/細(xì)胞生物學(xué)、lncRNA專題實(shí)驗(yàn)等科研服務(wù)。輝駿自有蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái),對蛋白的質(zhì)譜鑒定有十足的把控能力,對后續(xù)的生物信息分析有獨(dú)到的見解。


目前,我們已為上千位客戶在Nature、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發(fā)表IF>10的高分文獻(xiàn)(點(diǎn)擊查看客戶文獻(xiàn)),歡迎各位咨詢lc-ms/ms檢測實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)電話:4006991663

實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)-輝駿生物


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Q1:蛋白質(zhì)譜鑒定不成功一般有哪些因素?

A:質(zhì)譜鑒定不成功主要可以分為兩類,一類是質(zhì)譜效果不好,一類是沒有可參考的蛋白數(shù)據(jù)庫,質(zhì)譜效果不好的原因又可以細(xì)分為蛋白點(diǎn)太淡以至于蛋白含量過低(常見銀染的點(diǎn))、蛋白酶解及質(zhì)譜操作失誤等,要避免這些因素要盡量取顏色深一些的蛋白點(diǎn),并且取的蛋白點(diǎn)面積需要適當(dāng)大一些。


Q2:做蛋白鑒定檢索時(shí)為什么同一個(gè)編號對應(yīng)了很多蛋白質(zhì)?

A:因?yàn)橐粋€(gè)蛋白家族中常常含有多個(gè)同源性很高的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)被酶切之后,很可能會(huì)產(chǎn)生很多相同的肽段,軟件在進(jìn)行定性分析時(shí),就會(huì)將這些肽段均歸于得分高的那種蛋白質(zhì),其他同源蛋白不計(jì)分,并且這些同源蛋白都采用同一編號。


Q3:怎么判定哪些蛋白是和自己研究相關(guān)的蛋白,挑選什么樣的蛋白進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證?

A:需要研究人員根據(jù)自己研究的相關(guān)生物學(xué)背景,再結(jié)合生物信息學(xué)分析的結(jié)果,以及查看相關(guān)的文獻(xiàn)資料來確認(rèn)哪些蛋白可以用于后續(xù)深入的研究。后期的蛋白驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),一般情況下是根據(jù)客戶的需要,結(jié)合課題本身,在所篩選到的差異的蛋白中,找到自己關(guān)注的蛋白。并且在挑選的時(shí)候盡量挑蛋白可信度高的、差異變化較明顯的蛋白。目前驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的成功率比較低,一般情況下能有50%的概率已經(jīng)是非常好的結(jié)果。


Q4:蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果較少的可能原因是什么?

A:●根據(jù)樣品SDS-PAGE圖(注:SDS-PAGE無過度染色情況),判斷樣本本身的蛋白質(zhì)豐富程度,蛋白質(zhì)條帶較少或者較淺(含量低)都會(huì)導(dǎo)致鑒定結(jié)果不佳,可考慮增加樣本量再進(jìn)行檢測。

●根據(jù)SDS-PAGE圖判斷樣品中是否存在高豐度蛋白質(zhì),高豐度蛋白質(zhì)會(huì)影響樣本整體蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。

●有些物種的數(shù)據(jù)庫質(zhì)量不好,包含的蛋白數(shù)目過少,這種可以考慮換大一級的物種分類數(shù)據(jù)庫,或者選擇在進(jìn)化樹上同源性較近的、研究比較清楚的、基因組數(shù)據(jù)庫相對完整的模式物種的數(shù)據(jù)庫重新查庫。

●樣本中有污染或干擾物質(zhì),例如常見的有PEG、各種表面活性劑(如SDS、CHAPS、Triton、Tweens、NP-40等),一般在質(zhì)譜的表現(xiàn)為規(guī)律的分子量間隔約44的峰。

●輝駿生物會(huì)根據(jù)TIC、basepeak圖等,判斷酶解、儀器狀態(tài)等是否正常,如果是儀器問題導(dǎo)致的鑒定結(jié)果不好,我方會(huì)即刻告知客戶并安排重復(fù)實(shí)驗(yàn)。


Q5:LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裉峁┑鞍踪|(zhì)定量信息或確定樣品中不同蛋白質(zhì)的相對含量?

A:我們通常說的質(zhì)譜鑒定(LC-MS/MS實(shí)驗(yàn))為定性實(shí)驗(yàn),不能做定量分析,但如果您要比較某樣本中不同蛋白質(zhì)的相對含量,可參考蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果中的emPAI值(據(jù)譜圖數(shù)、肽段數(shù)或肽段得分等來獲得的近似定量信息)來大概評估每個(gè)蛋白的豐度情況,但這只是粗略估計(jì)。

如果您要比較蛋白在多組樣本間的相對表達(dá)差異,請選擇蛋白組組學(xué)的方法檢測,如label free,iTRAQ,TMTDIA等,并且通常需要設(shè)置樣本重復(fù),以便進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。


Q6:為什么質(zhì)譜檢測到的蛋白質(zhì)只是部分氨基酸序列,這樣的數(shù)據(jù)是否可信?

A:質(zhì)譜鑒定需要先進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解,酶解后的肽段再進(jìn)行質(zhì)譜分析。蛋白質(zhì)酶解成肽段的回收率不能達(dá)到100%,一定會(huì)發(fā)生肽段的損失;如果是膠內(nèi)酶解肽段的回收率會(huì)更低一些。

由于蛋白質(zhì)多種修飾形式的存在,會(huì)導(dǎo)致部分序列酶解不完全;或者由于蛋白質(zhì)的序列特點(diǎn)(酶切位點(diǎn)過于稀疏或者密集),導(dǎo)致酶切后的肽段過小或者過大,都不利于質(zhì)譜檢測。

 根據(jù)質(zhì)譜檢測原理,肽段需要被離子化后才能被檢測到。由于肽段序列特點(diǎn),導(dǎo)致某些不容易被離子化的片段很難被檢測到。

因此,質(zhì)譜法鑒定蛋白質(zhì)的結(jié)果一般都只是鑒定到蛋白質(zhì)的部分序列,即可以達(dá)到定性蛋白質(zhì)的目的。


Q7:質(zhì)譜結(jié)果鑒定到很多蛋白,如何評估蛋白的可信度,或者如果篩選蛋白進(jìn)行后續(xù)研究?

A:輝駿生物提供的鑒定表格中包括了原始蛋白列表和過濾后的蛋白列表,其中過濾后的蛋白列表中為篩選(pep_expect<0.05)后的蛋白,均為可信蛋白。所有蛋白按照得分排序,得分越高的蛋白可信度越高。但要注意,如果您做的是IP,pull down類實(shí)驗(yàn),有意義的蛋白可能由于本身豐度較低而得分低、排名靠后,針對這種情況我們建議您主要依據(jù)蛋白功能判斷,其次參考得分。


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