通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索,可以對目前已知的各種蛋白修飾類型(如磷酸化、乙?;?、甲基化、泛素化、琥珀?;龋┖鸵恍┬》肿铀幬镌诘鞍咨系男揎椢稽c(diǎn)進(jìn)行鑒定。為了更好的檢測到某特定蛋白的修飾位點(diǎn),需要在檢測前先采用IP、親和純化或SDS-PAGE等方法分離純化得到目的蛋白,該方法可以同時檢測多達(dá)8種已知的蛋白修飾類型。
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LC-MS/MS蛋白鑒定 | 蛋白溶液(干冰運(yùn)輸) 蛋白膠條/膠點(diǎn)(冰袋運(yùn)輸) 廣州地區(qū)可上門取樣 樣本信息表 | 蛋白及肽段鑒定結(jié)果表 質(zhì)譜檢索網(wǎng)頁 指定肽段的質(zhì)譜圖 質(zhì)譜原始數(shù)據(jù) 實(shí)驗報告 | 2周 |
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中文標(biāo)題:植物ESCRT組分FREE1穿梭到細(xì)胞核以減弱脫落酸信號
發(fā)表期刊:Nature Plants
影響因子:13.256
合作單位:華南師范大學(xué)
運(yùn)用技術(shù):IP-MS/MS磷酸化位點(diǎn)檢測(由輝駿生物提供技術(shù)支持)
內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(ESCRT)是真核生物中存在的保守的囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)器,由20多個蛋白組成并分成ESCRT-0, -I, -II, -III以及VPS4/SKD1-LIP5等5個蛋白復(fù)合物,它們協(xié)同作用識別泛素化修飾的膜蛋白并將其分選到細(xì)胞內(nèi)多泡體(MVB)的內(nèi)小泡中,這樣當(dāng)多泡體與液泡融合后,膜蛋白即被運(yùn)輸至液泡內(nèi)腔而被降解。已有研究表明,ESCRT蛋白參與了植物激素脫落酸(ABA)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。作者團(tuán)隊前期已經(jīng)發(fā)掘了植物特有的ESCRT復(fù)合物組分FREE1,并解析了其調(diào)控膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和自噬降解的功能,而有關(guān)ESCRT蛋白通過何組分以及哪種途徑參與植物激素脫r落酸(ABA)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),仍有待進(jìn)一步研究。
在這項研究中,研究者利用CRISPR-Cas9技術(shù)繞過FREE1功能缺失的致死性,得到一個特異影響FREE1蛋白入核的突變體Free1-ctmut。Sanger測序結(jié)果顯示該突變體倒數(shù)第二個外顯子內(nèi)有8bp的缺失(圖1A),這導(dǎo)致FREE1蛋白序列在581個氨基酸位點(diǎn)上有一個提前終止密碼子,引入了558-581個氨基酸殘基的外源多肽(圖1B)。WB分析檢測到Free1-ctmut植物中較小的內(nèi)源FREE1,表明產(chǎn)生了截短的FREE1蛋白,并缺失了羧基末端的尾巴(圖1C)。Free1-ctmut突變體在正常生長條件下沒有表現(xiàn)出明顯的表型,但與野生型(WT)植株相比,對ABA介導(dǎo)的抑制成苗和ABA誘導(dǎo)的離體葉片衰老表現(xiàn)出更高的敏感性。
FREE1蛋白有三個已知的結(jié)構(gòu)域,包括氨基末端的固有無序區(qū)、FYVE結(jié)構(gòu)域和C-末端卷曲圈區(qū)。為了深入了解FREE1蛋白不同結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)Free1-ctmut植株脫落酸(ABA)敏感性中的作用,本研究將4個不同版本的綠色熒光蛋白分別與FREE1、Free1-ctmut、FREE1(?FYVE)和FREE1(?CC)融合到Free1-ctmut中,并對其進(jìn)行了表型分析。如圖1D-F所示,全長FREE1完全補(bǔ)充了Free1-ctmut的ABA敏感表型,而C-末端截短的Free1-ctmut和FREE1(?CC)未能補(bǔ)充Free1-ctmut的表型,突出了FREE1 C末端在賦予Free1-ctmut植物的ABA超敏感表型中的功能重要性。先前的研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)REE1的N端部分負(fù)責(zé)其與ABA受體的相互作用,而這個新建立的Free1-ctmut植物中,缺失部分位于C端卷曲區(qū)域(圖1),理論上不影響FREE1與ABA受體的相互作用。因此,F(xiàn)ree1-ctmut的ABA超敏反應(yīng)不太可能是由MVB介導(dǎo)的空泡分選缺陷和ABA受體的降解引起的。研究者通過雜交實(shí)驗進(jìn)一步驗證猜想,并得出結(jié)論:Free1-ctmut作為ESCRT組分正常發(fā)揮作用,F(xiàn)REE1通過C末端負(fù)性調(diào)節(jié)ABA反應(yīng),其機(jī)制不同于先前報道的FREE1調(diào)節(jié)ABA受體內(nèi)體分選的功能。
圖1
接下來,研究者使用先前建立的GFP-FREE1/FREE1互補(bǔ)系觀察了FREE1亞細(xì)胞定位模式對ABA的響應(yīng)。有趣的是,ABA處理導(dǎo)致在共聚焦顯微鏡下觀察到的細(xì)胞核中GFP-FREE1的水平顯著增加,并在免疫印跡分析中檢測到。(圖2A,B)。此外,WT植株細(xì)胞核中內(nèi)源FREE1水平的增加對ABA的響應(yīng)進(jìn)一步支持了ABA促進(jìn)FREE1核進(jìn)入的結(jié)論(圖2C)。此外,在GFP-FREE1-CTmut/Free1-ctmut系(圖2D)中,細(xì)胞核中GFP-FREE1-CTmut的水平?jīng)]有明顯增加。此外,F(xiàn)REE1抗體的WB分析進(jìn)一步證實(shí),內(nèi)源FREE1-CTmut蛋白未能對ABA做出反應(yīng)而移位到細(xì)胞核(圖2E)。這些結(jié)果表明,F(xiàn)REE1可能通過其在細(xì)胞核內(nèi)的作用發(fā)揮其對ABA信號的抑制作用,而FREE1的C末端對于其穿梭到細(xì)胞核和植物對ABA的響應(yīng)是必不可少的。為了提高FREE1在細(xì)胞核中的表達(dá)水平,研究者建立了GFP-FREE1-NLS/FREE1-ctmut和GFP-FREE1-NES(Mut)/FREE1-ctmut轉(zhuǎn)基因株系。GFP-FREE1-NLS顯示顯性的細(xì)胞核定位,而GFP-FREE1-NES(Mut)在沒有ABA處理的情況下核定位明顯增加(圖2F)。進(jìn)一步的表型分析表明,GFP-FREE1-NLS和GFP-FREE1-NES(Mut)都能夠補(bǔ)充FREE1-ctmut對ABA的超敏表型(圖2G,H)。綜上所述,ABA處理促進(jìn)了FREE1的核積累,但不促進(jìn)FREE1-CTmut的核積累,次外,F(xiàn)REE1的核積累能夠補(bǔ)充FREE1-ctmut對ABA的敏感表型。
圖2
大量研究表明,磷酸化修飾可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)核質(zhì)穿梭。為了驗證FREE1在用ABA處理時是否會發(fā)生磷酸化修飾,研究者檢測了有或沒有ABA處理的FREE1的磷酸化水平,結(jié)果顯示ABA處理顯著增加了FREE1的磷酸化水平(圖3A)。在GFP-FREE1CTmut/FREE1-CTmut系中檢測FREE1-CTmut的磷酸化水平,結(jié)果表明,F(xiàn)REE1-CTmut磷酸化水平的增加遠(yuǎn)小于FREE1(圖3A),這表明ABA誘導(dǎo)的FREE1磷酸化需要C端。接下來,研究者在核和胞質(zhì)組分中檢測有無ABA處理的FREE1磷酸化水平,結(jié)果表明,磷酸化的FREE1主要位于細(xì)胞核中(圖3B),表明FREE1可能需要進(jìn)行磷酸化修飾才能在細(xì)胞核中積累。后續(xù)的時程和劑量反應(yīng)實(shí)驗也進(jìn)一步表明,ABA能夠誘導(dǎo)FREE1磷酸化,這需要FREE1的C末端;磷酸化的FREE1主要位于細(xì)胞核中。
圖3
多研究表明,SnRK2分支蛋白激酶,包括SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6,是介導(dǎo)植物對ABA反應(yīng)的關(guān)鍵正調(diào)控因子,ABA強(qiáng)烈激活A(yù)BA以進(jìn)一步磷酸化下游因子。為了測試SnRK2激酶是否磷酸化FREE1對ABA的響應(yīng),研究者通過雙分子熒光互補(bǔ)(BIFC)等分析證實(shí)了FREE1與SnRK2.2/2.3在擬南芥葉片原生質(zhì)體的細(xì)胞核和胞漿中的相互作用(圖3C)。Co-IP結(jié)果表明,ABA處理增強(qiáng)了FREE1與SnRK2.2和SnRK2.3之間的聯(lián)系(圖3D)。接下來,研究者利用幾個含有結(jié)構(gòu)域截斷的FREE1突變體,用于與SnRK2的相互作用分析。結(jié)果表明,F(xiàn)REE1的C-末端卷曲區(qū)負(fù)責(zé)與SnRK2.2和SnRK2.3的相互作用。
接下來,研究者進(jìn)行了體外磷酸化實(shí)驗,以測試SnRK2激酶是否直接磷酸化FREE1。將純化的His-SUMO-FREE1分別與ABA處理的轉(zhuǎn)基因植物GFP-SnRK2蛋白和大腸桿菌His-MBP-SnRK2蛋白孵育。在這兩種情況下,His-SUMO-FREE1的磷酸化都很容易檢測到(圖3E)。此外,體內(nèi)外實(shí)驗結(jié)果表明,SnRK2.2和SnRK2.3是ABA誘導(dǎo)FREE1磷酸化的預(yù)期激酶蛋白。為了進(jìn)一步揭示ABA誘導(dǎo)和SnRK2S依賴的FREE1磷酸化是否與ABA誘導(dǎo)的FREE1核導(dǎo)入有關(guān),研究者將GFP-FREE1導(dǎo)入現(xiàn)有SnRK2.2/2.3/2.6三重突變體的葉片原生質(zhì)體中,在ABA處理后的SnRK2.2/2.3/2.6原生質(zhì)體中沒有觀察到明顯的FREE1核導(dǎo)入增加(圖3F)。這一觀察結(jié)果得到證據(jù)的支持,即在ABA處理后,SnRK2.2/2.3/2.6三重突變體細(xì)胞核中內(nèi)源性FREE1的水平?jīng)]有明顯增加(圖3G)。綜上所述,這些結(jié)果表明,依賴于SnRK2.2和SnRK2.3的FREE1磷酸化對于ABA誘導(dǎo)的FREE1核進(jìn)口是必要的。
為了確定相應(yīng)的FREE1磷酸化殘基對ABA的響應(yīng),研究者對免疫沉淀的GFP-FREE1和GFP-Free1-ctmut蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示,在GFP-Free1-ctmut蛋白中檢測到的兩個磷酸化位點(diǎn)S530和S533位于FREE1 C-末端卷曲圈區(qū),而GFP-FREE1-CTmut蛋白中檢測不到。Free1-ctmut蛋白的缺失可能破壞了盤繞區(qū)域的結(jié)構(gòu),從而降低了S530和S533的磷酸化。因此,我們將目前的研究重點(diǎn)放在S530和S533在誘導(dǎo)ABA反應(yīng)中的功能特性上。
為了進(jìn)一步驗證S530和S533的磷酸化是否參與了ABA誘導(dǎo)的FREE1核輸入,我們將YFP-FREE1(S530A/S533A)和YFP-FREE1(S530D/S533D)這兩個絲氨酸位點(diǎn)突變?yōu)榉橇姿峄谋彼峄蛄姿峄奶於彼釟埢?,引入到FREE1突變株中,進(jìn)行FREE1定位觀察和植物表型分析。對ABA處理和未處理的植株不同蛋白質(zhì)組分的共聚焦觀察和免疫印跡分析均未發(fā)現(xiàn)YFP-FREE1(S530A/S533A)在細(xì)胞核內(nèi)明顯積聚(圖4B,C)。相反,YFP-FREE1(S530D/S533D)在沒有ABA處理的補(bǔ)充植株中表現(xiàn)出明顯的核積累(圖4D,E)。此外,與免疫沉淀-質(zhì)譜結(jié)果一致,ABA處理的轉(zhuǎn)基因植株和體外磷酸化實(shí)驗中純化的His-SUMO-FREE1(S530A/S533A)的YFPFREE1(S530A/S533A)的磷酸化水平都明顯降低(圖3E、4F)。YFP-FREE1(S530A/S533A)/Free1-ctmut表現(xiàn)出與Free1-ctmut相似的ABA過敏性,而YFP-FREE1(S530D/S533D)/Free1-ctmut在成苗和ABA誘導(dǎo)的葉片衰老方面與WT相似(圖4G,H),進(jìn)一步支持S530/S533的磷酸化是必需的。
圖4
為了研究FREE1在細(xì)胞核中的功能對ABA的響應(yīng),研究者以FREE1(231-601)的C末端部分為誘餌,在擬南芥互補(bǔ)DNA文庫中進(jìn)行了酵母雙雜交篩選,在陽性克隆鑒定了編碼轉(zhuǎn)錄激活因子ABF4和ABI5的克隆,用于進(jìn)一步的蛋白質(zhì)相互作用分析。酵母雙雜交結(jié)果顯示,ABF4和ABI5都與FREE1(231-601)相互作用(圖5A),BIFC分析進(jìn)一步證實(shí)了這種相互作用(圖5B)。在酵母雙雜交試驗中進(jìn)一步的精細(xì)定位表明,F(xiàn)ree1-ctmut(231-581)失去了與ABF4和ABI5的相互作用,而缺失了N末端的FREE1(421-601)仍然可以與這些轉(zhuǎn)錄因子相互作用。這些結(jié)果表明,F(xiàn)REE1的C端螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)iT負(fù)責(zé)與ABF4和ABI5的DNA結(jié)合域的相互作用(圖5A)。免疫共沉淀試驗表明,在沒有ABA的情況下,F(xiàn)REE1與ABF4或ABI5之間的相互作用很弱,但在ABA處理后得到加強(qiáng)(圖5C,D)。這些結(jié)果表明,F(xiàn)REE1C-末端殘基的磷酸化在調(diào)節(jié)ABA反應(yīng)中起著重要作用。
為了確定FREE1是否影響ABF4和ABI5在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活活性,研究者在擬南芥原生質(zhì)體中進(jìn)行了雙熒光素酶的報告實(shí)驗。結(jié)果表明,在ABF4或ABI5單獨(dú)存在的情況下,ABA顯著誘導(dǎo)PAO1或EM6的表達(dá),當(dāng)與GFP-FREE1共表達(dá)時,這種誘導(dǎo)被顯著抑制,但與GFP對照(圖5E,F(xiàn))不同,這表明FREE1直接抑制ABF4和ABI5對ABA的轉(zhuǎn)錄激活活性。接下來,為了檢測FREE1是否通過競爭性結(jié)合ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域來抑制這兩種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性,研究者通過電泳遷移率改變分析(EMSA)研究了FREE1對這兩種轉(zhuǎn)錄因子與下游基因順式調(diào)控序列結(jié)合活性的影響。結(jié)果表明,F(xiàn)REE1,而不是GFP對照,以劑量依賴的方式抑制ABF4和ABI5的DNA結(jié)合能力(圖5G,H),說明了FREE1對ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄激活活性的直接抑制作用。利用ChIP-qPCR方法進(jìn)一步檢測Free1-ctmut突變是否會導(dǎo)致GFP-ABF4和GFP-ABI5對其靶基因啟動子序列的富集作用增強(qiáng),并以GFP為陰性對照。結(jié)果表明,F(xiàn)REE1確實(shí)減弱了ABF4和ABI5對下游靶基因啟動子區(qū)域的DNA結(jié)合能力(圖5I,J)。
圖5
Free1-ctmut突變體對ABA的超敏表型很可能主要是由于ABF4和ABI5在細(xì)胞核內(nèi)過度激活而沒有FREE1抑制所致。為了證實(shí)這種可能性,研究者測試了ABF4或ABI5的缺失是否會通過使Free1-ctmut與ABF4或ABI5突變體雜交來挽救在Free1-ctmut突變體中觀察到的ABA超敏表型。與預(yù)期一致,F(xiàn)ree1-ctmut的ABF4或ABI5突變在成苗和ABA誘導(dǎo)的葉片衰老方面都表現(xiàn)出WT ABA反應(yīng)(圖6A,B),即Free1-ctmut的ABA敏感表型可能是由ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄活性的過度激活引起的。此外,接下來,研究者檢測了ABA反應(yīng)基因NYE1、NYC1、PAO1、RD29A、RD29B、NYE2和SAG29在WT、Free1-ctmut突變體ABF4、ABI5、Free1-ctmut/ABF4和Free1-ctmut/ABI5中的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示,所有檢測到的基因在未經(jīng)ABA處理的Free1-ctmut突變體中的表達(dá)均升高,而在ABA處理下,表達(dá)誘導(dǎo)的升高更為顯著。然而,ABF4或ABI5突變消除了Free1-ctmut中ABA反應(yīng)基因的這種表達(dá)誘導(dǎo)(圖6C,D)??傊?,這些結(jié)果表明,在Free1-ctmut中ABA反應(yīng)基因的表達(dá)上調(diào)是由于ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄活性的過度激活所致。
圖6
研究在轉(zhuǎn)錄水平上證明了細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)和ABA信號之間的串?dāng)_,并強(qiáng)調(diào)了植物ESCRT亞基FREE1的兼職特性,它除了在細(xì)胞質(zhì)中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用外,還在細(xì)胞核中進(jìn)化了獨(dú)特的非內(nèi)體功能。
A:質(zhì)譜鑒定不成功主要可以分為兩類,一類是質(zhì)譜效果不好,一類是沒有可參考的蛋白數(shù)據(jù)庫,質(zhì)譜效果不好的原因又可以細(xì)分為蛋白點(diǎn)太淡以至于蛋白含量過低(常見銀染的點(diǎn))、蛋白酶解及質(zhì)譜操作失誤等,要避免這些因素要盡量取顏色深一些的蛋白點(diǎn),并且取的蛋白點(diǎn)面積需要適當(dāng)大一些。
A:因為一個蛋白家族中常常含有多個同源性很高的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)被酶切之后,很可能會產(chǎn)生很多相同的肽段,軟件在進(jìn)行定性分析時,就會將這些肽段均歸于得分高的那種蛋白質(zhì),其他同源蛋白不計分,并且這些同源蛋白都采用同一編號。
A:需要研究人員根據(jù)自己研究的相關(guān)生物學(xué)背景,再結(jié)合生物信息學(xué)分析的結(jié)果,以及查看相關(guān)的文獻(xiàn)資料來確認(rèn)哪些蛋白可以用于后續(xù)深入的研究。后期的蛋白驗證實(shí)驗,一般情況下是根據(jù)客戶的需要,結(jié)合課題本身,在所篩選到的差異的蛋白中,找到自己關(guān)注的蛋白。并且在挑選的時候盡量挑蛋白可信度高的、差異變化較明顯的蛋白。目前驗證實(shí)驗的成功率比較低,一般情況下能有50%的概率已經(jīng)是非常好的結(jié)果。
A:●根據(jù)樣品SDS-PAGE圖(注:SDS-PAGE無過度染色情況),判斷樣本本身的蛋白質(zhì)豐富程度,蛋白質(zhì)條帶較少或者較淺(含量低)都會導(dǎo)致鑒定結(jié)果不佳,可考慮增加樣本量再進(jìn)行檢測。
●根據(jù)SDS-PAGE圖判斷樣品中是否存在高豐度蛋白質(zhì),高豐度蛋白質(zhì)會影響樣本整體蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。
●有些物種的數(shù)據(jù)庫質(zhì)量不好,包含的蛋白數(shù)目過少,這種可以考慮換大一級的物種分類數(shù)據(jù)庫,或者選擇在進(jìn)化樹上同源性較近的、研究比較清楚的、基因組數(shù)據(jù)庫相對完整的模式物種的數(shù)據(jù)庫重新查庫。
●樣本中有污染或干擾物質(zhì),例如常見的有PEG、各種表面活性劑(如SDS、CHAPS、Triton、Tweens、NP-40等),一般在質(zhì)譜的表現(xiàn)為規(guī)律的分子量間隔約44的峰。
●輝駿生物會根據(jù)TIC、basepeak圖等,判斷酶解、儀器狀態(tài)等是否正常,如果是儀器問題導(dǎo)致的鑒定結(jié)果不好,我方會即刻告知客戶并安排重復(fù)實(shí)驗。
A:●我們通常說的質(zhì)譜鑒定(LC-MS/MS實(shí)驗)為定性實(shí)驗,不能做定量分析,但如果您要比較某樣本中不同蛋白質(zhì)的相對含量,可參考蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果中的emPAI值(據(jù)譜圖數(shù)、肽段數(shù)或肽段得分等來獲得的近似定量信息)來大概評估每個蛋白的豐度情況,但這只是粗略估計。
●如果您要比較蛋白在多組樣本間的相對表達(dá)差異,請選擇蛋白組組學(xué)的方法檢測,如label free,iTRAQ,TMT或DIA等,并且通常需要設(shè)置樣本重復(fù),以便進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
A:●質(zhì)譜鑒定需要先進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解,酶解后的肽段再進(jìn)行質(zhì)譜分析。蛋白質(zhì)酶解成肽段的回收率不能達(dá)到100%,一定會發(fā)生肽段的損失;如果是膠內(nèi)酶解肽段的回收率會更低一些。
●由于蛋白質(zhì)多種修飾形式的存在,會導(dǎo)致部分序列酶解不完全;或者由于蛋白質(zhì)的序列特點(diǎn)(酶切位點(diǎn)過于稀疏或者密集),導(dǎo)致酶切后的肽段過小或者過大,都不利于質(zhì)譜檢測。
● 根據(jù)質(zhì)譜檢測原理,肽段需要被離子化后才能被檢測到。由于肽段序列特點(diǎn),導(dǎo)致某些不容易被離子化的片段很難被檢測到。
●因此,質(zhì)譜法鑒定蛋白質(zhì)的結(jié)果一般都只是鑒定到蛋白質(zhì)的部分序列,即可以達(dá)到定性蛋白質(zhì)的目的。
A:輝駿生物提供的鑒定表格中包括了原始蛋白列表和過濾后的蛋白列表,其中過濾后的蛋白列表中為篩選(pep_expect<0.05)后的蛋白,均為可信蛋白。所有蛋白按照得分排序,得分越高的蛋白可信度越高。但要注意,如果您做的是IP,pull down類實(shí)驗,有意義的蛋白可能由于本身豐度較低而得分低、排名靠后,針對這種情況我們建議您主要依據(jù)蛋白功能判斷,其次參考得分。
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