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實驗簡介買此服務(wù)

SILAC-IP * 實驗原理


用SILAC結(jié)合免疫共沉淀(CoIP)尋找相互作用蛋白是SILAC在定量蛋白質(zhì)組學研究基礎(chǔ)上的進一步應(yīng)用,稱之為SILAC-IP技術(shù)。該技術(shù)通過質(zhì)譜鑒定和分析蛋白質(zhì)相對量來判斷是否是特異性結(jié)合誘餌蛋白,當實驗組與對照組中某個蛋白質(zhì)量含量達到統(tǒng)計學的差異時,就判定這個蛋白質(zhì)與誘餌蛋白質(zhì)具有相互作用。SILAC技術(shù)是先將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素,即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復(fù)合物分離后,混在同一管中做酶切質(zhì)譜等。這樣既能鑒定到復(fù)合物蛋白,又能根據(jù)同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量,從而更準確地判斷出互作蛋白。





SILAC-IP * 實驗方案



不同的實驗背景和目的需對應(yīng)用不同方案,輝駿生物提供以下三種SILAC-IP實驗方案:



方案一:以野生型細胞株為實驗材料


1.分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)細胞,取等量標記好的細胞提取蛋白質(zhì);
2.提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做Co-IP;
3.混合輕、重鏈Co-IP產(chǎn)物;
4.胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。


SILAC免疫共沉淀技術(shù)服務(wù)_SILAC-IP_silac ip實驗外包公司.jpg


方案二:以過表達誘餌蛋白的細胞株為實驗材料


1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)正常對照細胞和過表達誘餌蛋白的細胞株(帶標簽),取等量標記好的細胞分別提取蛋白質(zhì),并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

SILAC IP代做_silac ip外包平臺.jpg



方案三:以干擾誘餌蛋白的細胞株為實驗材料


1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養(yǎng)RNAi 誘餌蛋白的細胞株和正常對照細胞株,取等量標記好的細胞分別提取蛋白質(zhì),并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

SILAC-IP外包實驗,silac ip技術(shù)服務(wù),silac ip檢測實驗.jpg



SILAC-IP * 應(yīng)用背景


免疫共沉淀(Co-IP)在分離純化蛋白復(fù)合物過程中,不可避免地會出現(xiàn)非特異結(jié)合蛋白,這些蛋白會一并被質(zhì)譜鑒定出來,成為假陽性的互作蛋白,影響后續(xù)挑選驗證。 傳統(tǒng)的判斷假陽性互作蛋白方法是:用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表,扣除掉對照組鑒定到的蛋白列表,作為“互作蛋白”。但很多真實的互作蛋白,比如豐度比較高的蛋白,在對照組中也會出現(xiàn),而傳統(tǒng)的方法就會被排除掉。SILAC-IP技術(shù)將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素,結(jié)合質(zhì)譜分析,既能鑒定到復(fù)合物蛋白,又能根據(jù)同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量,從而更準確地判斷出互作蛋白。

相較于傳統(tǒng)的免疫共沉淀和pull down技術(shù),SILAC-IP技術(shù)特異性強,假陽性極低,通量高,靈敏度高,能直接檢測出與bait蛋白互作的其他蛋白的相對含量;適合于可傳代細胞,尤其是易轉(zhuǎn)基因細胞。


添加技術(shù)員微信溝通實驗
18927549347



SILAC-IP * 輝駿服務(wù)內(nèi)容


SILAC-IP(SILAC標記的免疫共沉淀)檢測服務(wù)
服務(wù)項目服務(wù)內(nèi)容結(jié)果交付實驗周期客戶提供價格
SILAC-IPCo-IP預(yù)實驗input和CoIP產(chǎn)物的Western blot檢測圖
2-3周

未標記的待測細胞

SILAC標記完全的待測細胞

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表(樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列)


點擊詢價




 


SILAC標記效率檢測

標記效率檢測表

標記效率檢測報告

2-3周
Western blot檢測SILAC標記細胞(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖7-8周
CoIP實驗調(diào)取誘餌蛋白及其互作蛋白

Western blot檢測圖

CoIP實驗報告

IP產(chǎn)物的SILAC蛋白定量檢測和分析

質(zhì)譜檢索表

互作蛋白篩選表

互作蛋白生物信息學分析結(jié)果

SILAC檢測和分析報告





SILAC-IP * 結(jié)果示例



圖片.png

silac ip:質(zhì)譜檢索表格(部分展示)




SILAC-IP  * 客戶文獻


1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017,IF=2.629.

【研究內(nèi)容】:為了更好地研究CREB/ATF家族成員SCIRR69在ER應(yīng)激過程中的功能作用,研究者首先用ER應(yīng)激激活劑(TG)和衣霉素(TM)處理了SCN和PC12細胞,,qRT-PCR和western結(jié)果顯示SCIRR69可能在ER應(yīng)激中起重要作用。采用SILAC IP方法篩選出ER過程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1,并通過Co-IP技術(shù)驗證了它們與SCIRR69的相互作用。研究結(jié)果有助于更好地理解SCIRR69在ER應(yīng)激中的基本功能。

使用相關(guān)技術(shù):silac ip檢測、silac ip服務(wù)、SILAC IP免疫共沉淀實驗服務(wù)


2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014,IF=1.163.

【研究內(nèi)容】:每個骨髓瘤患者都有多個亞克隆,具有高或低染色體不穩(wěn)定性(CIN)特征的多個亞克隆共存會導(dǎo)致異質(zhì)性和耐藥性,導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。作者通過串聯(lián)親和純化質(zhì)譜(TAP-MS)技術(shù),發(fā)現(xiàn)了CIN基因NEK2與脫泛素酶USP7結(jié)合。該結(jié)合阻止了NEK2泛素化并使其穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn),使用NEK2或USP7抑制劑進行靶向治療可能是骨髓瘤最有效的輔助治療方法。

使用相關(guān)技術(shù):silac ip技術(shù)、silac ip免疫共沉淀、SILAC-IP質(zhì)譜





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SILAC-IP(SILAC標記的免疫共沉淀)服務(wù)介紹


SILAC-IP是在SILAC標記細胞中進行Co-IP(免疫共沉淀)的技術(shù)。


SILAC-IP(SILAC標記的免疫共沉淀)檢測服務(wù)
服務(wù)項目服務(wù)內(nèi)容結(jié)果交付實驗周期客戶提供價格
SILAC-IPCo-IP預(yù)實驗確定抗體拉取效果input和CoIP產(chǎn)物Western blot檢測圖
2-3周

待測細胞及其培養(yǎng)方法

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表(樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列)


點擊詢價




 


Western blot檢測SILAC標記細胞(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖7-8周
CoIP實驗調(diào)取誘餌蛋白及其互作蛋白

Western blot檢測圖

SILAC蛋白定量檢測Co-IP產(chǎn)物的蛋白、篩選誘餌蛋白的互作蛋白

質(zhì)譜檢索表

互作蛋白篩選表格

SILAC-IP實驗報告

針對互作蛋白做生物信息學分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息學分析結(jié)果和報告1周


添加技術(shù)員微信溝通實驗
18927549347




SILAC IP實驗服務(wù)*輝駿優(yōu)勢

1

近十年服務(wù)經(jīng)驗,眾多服務(wù)案例,服務(wù)成果得到優(yōu)秀期刊認可。

2

對蛋白互作的篩選鑒定理解深刻,擅長針對客戶情況提出合適的方案建議。

3

自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執(zhí)行最優(yōu)的實驗路線

4

自有蛋白質(zhì)組學平臺,對微量互作蛋白的質(zhì)譜鑒定有十足的把控能力,對后續(xù)的生物信息分析有獨到的見解。

5

售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章,確??蛻舭残倪M行下游實驗及投稿。





SILAC標記的免疫共沉淀實驗樣本要求


1. 送樣要求

樣本類型
建議送樣量
待測細胞

(廣州市內(nèi)客戶)可接受活細胞,2個T25瓶,細胞匯合度>80%;

(其他地區(qū)客戶)凍存細胞2管。


2. 樣本保存和運輸要求:

(1)活細胞常溫取樣;

(2)凍存細胞干冰取樣/運輸:需要至少在送樣前一天通知我方。





silac-ip技術(shù)服務(wù)結(jié)果示例


圖片.png

silac ip:質(zhì)譜檢索表格(部分展示)





免疫共沉淀SILAC-IP 客戶文獻


1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017,IF=2.629.

【研究內(nèi)容】:為了更好地研究CREB/ATF家族成員SCIRR69在ER應(yīng)激過程中的功能作用,研究者首先用ER應(yīng)激激活劑(TG)和衣霉素(TM)處理了SCN和PC12細胞,,qRT-PCR和western結(jié)果顯示SCIRR69可能在ER應(yīng)激中起重要作用。采用SILAC IP方法篩選出ER過程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1,并通過Co-IP技術(shù)驗證了它們與SCIRR69的相互作用。研究結(jié)果有助于更好地理解SCIRR69在ER應(yīng)激中的基本功能。

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