SILAC-IP * 實驗原理
用SILAC結(jié)合免疫共沉淀(CoIP)尋找相互作用蛋白是SILAC在定量蛋白質(zhì)組學研究基礎(chǔ)上的進一步應(yīng)用,稱之為SILAC-IP技術(shù)。該技術(shù)通過質(zhì)譜鑒定和分析蛋白質(zhì)相對量來判斷是否是特異性結(jié)合誘餌蛋白,當實驗組與對照組中某個蛋白質(zhì)量含量達到統(tǒng)計學的差異時,就判定這個蛋白質(zhì)與誘餌蛋白質(zhì)具有相互作用。SILAC技術(shù)是先將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素,即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復(fù)合物分離后,混在同一管中做酶切質(zhì)譜等。這樣既能鑒定到復(fù)合物蛋白,又能根據(jù)同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量,從而更準確地判斷出互作蛋白。
SILAC-IP * 實驗方案
不同的實驗背景和目的需對應(yīng)用不同方案,輝駿生物提供以下三種SILAC-IP實驗方案:
方案一:以野生型細胞株為實驗材料
1.分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)細胞,取等量標記好的細胞提取蛋白質(zhì);
2.提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做Co-IP;
3.混合輕、重鏈Co-IP產(chǎn)物;
4.胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。
方案二:以過表達誘餌蛋白的細胞株為實驗材料
1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)正常對照細胞和過表達誘餌蛋白的細胞株(帶標簽),取等量標記好的細胞分別提取蛋白質(zhì),并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。
方案三:以干擾誘餌蛋白的細胞株為實驗材料
1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養(yǎng)RNAi 誘餌蛋白的細胞株和正常對照細胞株,取等量標記好的細胞分別提取蛋白質(zhì),并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。
SILAC-IP * 應(yīng)用背景
免疫共沉淀(Co-IP)在分離純化蛋白復(fù)合物過程中,不可避免地會出現(xiàn)非特異結(jié)合蛋白,這些蛋白會一并被質(zhì)譜鑒定出來,成為假陽性的互作蛋白,影響后續(xù)挑選驗證。 傳統(tǒng)的判斷假陽性互作蛋白方法是:用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表,扣除掉對照組鑒定到的蛋白列表,作為“互作蛋白”。但很多真實的互作蛋白,比如豐度比較高的蛋白,在對照組中也會出現(xiàn),而傳統(tǒng)的方法就會被排除掉。SILAC-IP技術(shù)將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素,結(jié)合質(zhì)譜分析,既能鑒定到復(fù)合物蛋白,又能根據(jù)同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量,從而更準確地判斷出互作蛋白。
相較于傳統(tǒng)的免疫共沉淀和pull down技術(shù),SILAC-IP技術(shù)特異性強,假陽性極低,通量高,靈敏度高,能直接檢測出與bait蛋白互作的其他蛋白的相對含量;適合于可傳代細胞,尤其是易轉(zhuǎn)基因細胞。
SILAC-IP * 輝駿服務(wù)內(nèi)容
SILAC-IP(SILAC標記的免疫共沉淀)檢測服務(wù) |
服務(wù)項目 | 服務(wù)內(nèi)容 | 結(jié)果交付 | 實驗周期 | 客戶提供 | 價格
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SILAC-IP | Co-IP預(yù)實驗 | input和CoIP產(chǎn)物的Western blot檢測圖
| 2-3周 | 未標記的待測細胞 SILAC標記完全的待測細胞 誘餌蛋白的IP級抗體 實驗信息表(樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列) |
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SILAC標記效率檢測 | 標記效率檢測表 標記效率檢測報告 | 2-3周 |
Western blot檢測SILAC標記細胞(input)中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 | 7-8周 |
CoIP實驗調(diào)取誘餌蛋白及其互作蛋白 | Western blot檢測圖 CoIP實驗報告 |
IP產(chǎn)物的SILAC蛋白定量檢測和分析 | 質(zhì)譜檢索表 互作蛋白篩選表 互作蛋白生物信息學分析結(jié)果 SILAC檢測和分析報告 |
SILAC-IP * 結(jié)果示例
silac ip:質(zhì)譜檢索表格(部分展示)
SILAC-IP * 客戶文獻
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