TMT(Tandem Mass Tags)是由美國Thermo公司研發(fā)的體外同重同位素標(biāo)記的定量技術(shù)。該技術(shù)采用10-plex或16-plex標(biāo)記試劑,可以同時比較10組或16組樣本之間的蛋白表達(dá)差異。TMT同位素試劑標(biāo)記多肽氨基基團(tuán)后,等量混勻多肽并進(jìn)行LC-MS/MS分析。一級質(zhì)譜中,不同樣品來源的同一肽段表現(xiàn)出相同的m/Z;二級質(zhì)譜中,化學(xué)鍵斷裂釋放出報告離子,低質(zhì)量區(qū)的報告離子強(qiáng)度反映了該肽段在不同樣品中的相對表達(dá)量,高質(zhì)量區(qū)的肽段碎片離子m/Z反映了該肽段的序列信息。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索,即可得到樣本中所含蛋白及其表達(dá)差異。
基礎(chǔ)醫(yī)學(xué):疾病標(biāo)志物,發(fā)病機(jī)制,疾病分型等;
生物醫(yī)藥:藥物機(jī)理,藥效評價,藥物開發(fā)等;
農(nóng)林畜漁:抗逆脅迫,生長發(fā)育,耐藥,致病機(jī)理等。
1
高通量: 16-plex TMT試劑盒可同時標(biāo)記最多 16組樣本
2
適用范圍廣:幾乎可對任何物種的各類蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定,不受蛋白大小或酸堿性等因素影響
3
靈敏度高:低豐度蛋白也能檢出
4
定量準(zhǔn)確:不同標(biāo)記的肽段等量混合后上機(jī),避免技術(shù)誤差,提高檢測效率
項目名稱 | 客戶提供 | 結(jié)果交付 | 實驗周期 | 價格 |
TMT | 原始樣本(-80℃保存,干冰運(yùn)輸) | 1、蛋白鑒定及定量結(jié)果表 | 5-6周 |
? miRNA靶基因驗證
? 慢病毒包裝
? 人cDNA克隆庫
? 慢病毒干擾載體
? 抗體從頭測序
? COIP 試劑盒
? Flag 試劑盒
4899+客戶已添加微信獲取實驗優(yōu)惠!
中文標(biāo)題:酪氨酸激酶Fyn通過激活β-連環(huán)蛋白途徑促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎
發(fā)表期刊:Ann Rheum dis
影響因子:14.299
發(fā)表時間:2018年
合作單位:南方醫(yī)科大學(xué)
運(yùn)用技術(shù):TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析(由輝駿生物提供技術(shù)支持)
骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種年齡相關(guān)性或創(chuàng)傷后退行性關(guān)節(jié)疾病,其確切的發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前OA尚無有效的疾病修飾治療方法,迫切需要開發(fā)新的治療藥物。因此,了解控制軟骨細(xì)胞肥大和調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制對于開發(fā)有效的OA治療方法具有重要意義。
1. 樣本分析證實Fyn在老年小鼠、創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎小鼠和人類骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨中聚集
2. 基因敲除實驗表明Fyn基因缺失阻止小鼠創(chuàng)傷后和年齡相關(guān)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生
3. 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)證實Fyn與軟骨細(xì)胞中的β- catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩(wěn)定
4. 抑制劑治療顯示FYN抑制劑AZD0530和PP1抑β- catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并阻止小鼠骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生
研究者首先選取年輕(2個月)和老年(12個月)小鼠的關(guān)節(jié)軟骨來識別與軟骨退化有關(guān)的蛋白質(zhì)。其中酪氨酸激酶Fyn是老年軟骨中表達(dá)最強(qiáng)的蛋白(圖1A)。對4、13和24月齡小鼠的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行Western blotting分析,證實了老化軟骨中Fyn的顯著增加(圖1B),F(xiàn)yn的積累伴隨著老年小鼠軟骨的退化和OARSI分級的增加(圖1C,D)。為了確定Fyn在人OA關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)是否升高,研究者比較了接受過全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的老年OA患者(年齡67.00±3.03歲)軟骨和無關(guān)節(jié)炎病史的年輕交通事故患者(30.25±8.18歲)的正常軟骨中Fyn的表達(dá)。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),老年組和OA組軟骨細(xì)胞中Fyn水平明顯升高,同時OA組軟骨結(jié)構(gòu)發(fā)生變性和丟失(圖1E,F(xiàn))。這些結(jié)果表明,Src激酶家族成員Fyn在老年小鼠和OA患者的退變和損傷的關(guān)節(jié)軟骨中聚集。
圖1
為了確定Fyn在退變或受損軟骨的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中積聚的意義,研究者進(jìn)行了Fyn基因敲除實驗。Western blotting分析顯示了8周齡小鼠軟骨中Fyn基因的缺失(圖2A,B)。與對照組相比,基因敲除組(Fyn-KO小鼠)關(guān)節(jié)軟骨或生長板的形態(tài)和組織均沒有明顯差異,這表明Fyn基因的缺失沒有引起小鼠骨骼發(fā)育異常。與對照組相比,F(xiàn)yn-KO組小鼠的軟骨中的蛋白質(zhì)含量顯著減少,TUNEL染色顯示Fyn-KO小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡明顯減少(圖2G),軟骨降解程度有所降低。這些結(jié)果表明,F(xiàn)yn的缺失有效地阻止了小鼠創(chuàng)傷后和年齡依賴性O(shè)A的發(fā)展。
圖2
為了探討Fyn促進(jìn)OA發(fā)生的機(jī)制,研究者通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對軟骨前體細(xì)胞系A(chǔ)TDC5中與Fyn相互作用的蛋白進(jìn)行了鑒定,在純化的復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)β-catenin可能是FYN的潛在互作伙伴(圖3A)。IP分析證實β-catenin與Fyn在ATDC5細(xì)胞(圖3B)、原代軟骨細(xì)胞和軟骨組織中存在相互作用。β-catenin和Fyn的雙重染色也顯示β-catenin與Fyn在ATDC5細(xì)胞中共定位(圖3C)。為了確定Fyn是否磷酸化軟骨細(xì)胞中的β-catenin,研究者在ATDC5細(xì)胞中進(jìn)行了體外Fyn激酶檢測。結(jié)果顯示,F(xiàn)yn免疫沉淀使β-catenin在體外Tyr142處磷酸化,這種磷酸化被Fyn激酶抑制劑PP1或AZD0530抑制(圖3D)。此外,β-catenin及其磷酸化(Tyr142)的表達(dá)通過Fyn SiRNA被顯著下調(diào)(圖3E),但在ATDC5細(xì)胞中通過Fyn編碼質(zhì)粒的Fyn過表達(dá)而增強(qiáng)(圖3F)。為了驗證Fyn在β-catenin信號通路中的關(guān)鍵作用,研究者在ATDC5細(xì)胞中檢測了鈣粘附素-catenin復(fù)合體的形成。PP1對Fyn的抑制或siRNA下調(diào)Fyn的表達(dá)可以穩(wěn)定鈣粘連蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合體,而Fyn的過度表達(dá)則破壞了該復(fù)合體(圖3H)。這些數(shù)據(jù)表明,F(xiàn)yn與β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩(wěn)定,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中鈣粘連蛋白-catenin復(fù)合體的解離。
圖3
在Fyn和β-catenin的雙重染色中發(fā)現(xiàn),隨著Fyn水平的增加,β-catenin從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核(圖4A)。用促炎因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)處理ATDC5細(xì)胞,誘導(dǎo)Fyn和β-catenin在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的積聚(圖4B),并增加Fyn的表達(dá)和磷酸化水平(Tyr416),β-catenin的表達(dá)和磷酸化水平(Tyr142),以及MMP13的表達(dá)(圖4C)。接下來,研究者評估了老年小鼠和創(chuàng)傷后OA小鼠軟骨中β-catenin及其磷酸化的水平。結(jié)果顯示,β-catenin及其磷酸化水平隨著年齡的增長和OA的加重而增加(圖4D)。此外,創(chuàng)傷后FYN-KO小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的β-catenin水平及其核定位明顯低于對照組(圖4F)。WNT3a是典型的Wnt/β-catenin途徑的激活劑。Fyn的敲除實驗顯示,在OA的發(fā)生發(fā)展過程中,F(xiàn)yn激活了不依賴Wnt信號的β-catenin通路,并增強(qiáng)了β-catenin在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)位。關(guān)節(jié)注射icg-001明顯減少了軟骨損傷,維持了關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖的含量,并降低了OA發(fā)生過程中的關(guān)節(jié)炎分級,退變軟骨中MMP13和ADAMTS5的表達(dá)水平也相應(yīng)降低。這些結(jié)果表明,β-catenin通路參與了Fyn刺激軟骨細(xì)胞MMP13和ADAMTS5的表達(dá)以及小鼠OA的發(fā)生與發(fā)展。
圖4
為了研究Fyn作為OA治療靶點(diǎn)的潛在用途,研究者檢測了Fyn的化學(xué)抑制劑在OA的發(fā)病和進(jìn)展中的作用。AZD0530和PP1是Src激酶(包括Fyn)的選擇性抑制劑,可用于癌癥的治療。注射小鼠后,與賦形劑治療的小鼠相比,AZD0530和PP1治療顯著減少了軟骨的破壞(圖5A)、OARSI分級(圖5B)和滑膜炎癥,MMP13、ADAMTS5和X膠原含量、TUNEL陽性軟骨細(xì)胞數(shù)和骨鈣素表達(dá)也顯著減少(圖5C,D)。這些結(jié)果表明,抑制Fyn激酶活性可以阻止小鼠創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。Western blotting顯示AZD0530或PP1可阻斷IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上調(diào),并抑制p-β-catenin(Tyr142)的增加(圖5E)。接下來,研究者檢測了用或不用AZD0530或PP1AZD0530或PP1治療的創(chuàng)傷后OA小鼠的軟骨樣本中p-β-catenin(Tyr142)的表達(dá)。結(jié)果顯示,AZD0530和PP1處理的小鼠,MMP13、p-FYN和p-β-catenin(Tyr142)的表達(dá)均明顯降低(圖5F)。此外,用AZD0530或PP1治療OA時,F(xiàn)yn和β-catenin在軟骨細(xì)胞核中的共存也被取消(圖5G)。這些結(jié)果表明,AZD0530和PP1通過抑制FYN誘導(dǎo)的磷酸化β-catenin的表達(dá)來預(yù)防OA的發(fā)生。
圖5
iTRAQ及TMT等標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)有什么特點(diǎn)?
iTRAQ以及TMT等標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)分辨率高,細(xì)胞樣品最多可鑒定超過6000個蛋白,并且絕大多數(shù)蛋白都有定量和定性信息;其次是通量高,可以一次最多完成8個(iTRAQ)或者10個(TMT)樣品的實驗,特別適合于多組樣品間的同時比較以及生物學(xué)過程的動態(tài)檢測。
沒有全基因組數(shù)據(jù)的物種該如何進(jìn)行蛋白的鑒定?
對于已經(jīng)公布全基因組序列的物種,可以在得到全序列后構(gòu)建本地建庫并進(jìn)行本地檢索;對于未進(jìn)行全基因組測序的物種,可以采用近緣物種的數(shù)據(jù)庫或者EST數(shù)據(jù)以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索。
上一篇:Western Blot
下一篇:iTRAQ標(biāo)記定量
官方微信
電子郵箱
service@fitgene.com
聯(lián)系電話
020-32053431 / 400-699-1663
聯(lián)系地址
廣州市黃埔區(qū)科學(xué)城廣州國際企業(yè)孵化器D506
?2011-2024 廣州輝駿生物科技股份有限公司 主營業(yè)務(wù):RNA pull down DNA pull down GST pull down CoIP LC-MS/MS TAP-MS 抗體測序 版權(quán)所有 粵ICP備19156356號 | 網(wǎng)站地圖