穩(wěn)定細胞株構(gòu)建技術(shù)實驗原理

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建是將外源DNA通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染的方法導(dǎo)入細胞，實現(xiàn)基因穩(wěn)定表達或干擾的技術(shù)。由于慢病毒可將外源片段穩(wěn)定整合入宿主細胞基因組，因此特別適合用于穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建。慢病毒感染比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更容易操作，并且對各類細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率都很高，篩選周期短。

轉(zhuǎn)入外源基因的細胞選用與載體抗性標簽對應(yīng)的藥物進行細胞篩選，從而得到可穩(wěn)定表達/沉默目的基因的細胞株。最常用的抗性篩選標志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin) 。

穩(wěn)定細胞株構(gòu)建技術(shù)實驗流程

穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建實驗流程.jpg

穩(wěn)定細胞株構(gòu)建服務(wù)信息

輝駿生物提供的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建服務(wù)主要分為以下兩種：

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建服務(wù)
服務(wù)項目	服務(wù)內(nèi)容	結(jié)果交付	實驗周期	客戶提供
表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建	構(gòu)建基因表達慢病毒載體	載體質(zhì)粒、甘油菌、測序結(jié)果和報告	2-3周	1.細胞及其培養(yǎng)方法 2. 實驗信息表（相關(guān)基因信息、載體要求等）
	包裝基因表達慢病毒	篩選好的表達細胞株、對照細胞株和報告	9-10周
	感染并篩選穩(wěn)定表達細胞株	篩選好的表達細胞株、對照細胞株和報告
	qPCR檢測表達效率	檢測結(jié)果和報告
shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建	針對基因序列設(shè)計并構(gòu)建3個shRNA慢病毒載體	載體質(zhì)粒、甘油菌、測序結(jié)果和報告	2-3周	1.細胞及其培養(yǎng)方法 2. 實驗信息表（相關(guān)基因信息、載體要求等）
	shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞進行干擾效率檢測	干擾效率檢測結(jié)果和報告	2周
	干擾效率最高的shRNA質(zhì)粒包裝慢病毒	篩選好的shRNA細胞株、對照細胞株和報告	9-10周
	感染并篩選穩(wěn)定表達細胞株	篩選好的shRNA細胞株、對照細胞株和報告
	qPCR檢測表達效率	檢測結(jié)果和報告

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**穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建技術(shù)服務(wù)*輝駿優(yōu)勢**

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穩(wěn)定細胞株構(gòu)建實驗結(jié)果示例

穩(wěn)定細胞系熒光檢測圖

穩(wěn)定細胞株構(gòu)建-客戶文章

Yang T. et al: CD151 promotes Colorectal Cancer progression by a crosstalk involving CEACAM6, LGR5 and Wnt signaling via TGFβ1. Int J Biol Sci. 2021, IF 6.58.

【研究內(nèi)容】：研發(fā)發(fā)現(xiàn)CD151在結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)組織中表達較高，能促進癌細胞增殖、遷移和侵襲。RNA-seq和CoIP-MS實驗同時檢測和篩選了受CD151表達影響且與CD151相互作用的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了3個蛋白——TGFβ1，CEACAM6和LGR5。pull down和免疫熒光實驗確定了它們間的相互作用。基因沉默和回復(fù)實驗進一步表明，CD151可能通過TGFβ1來促進CEACAM6、LGR5和Wnt通路。

使用技術(shù)：shRNA慢病毒載體構(gòu)建、慢病毒包裝、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建

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Wu M.H. et al: MafF Is Regulated via the circ-ITCH/miR-224-5p Axis and Acts as a Tumor Suppressor in Hepatocellular Carcinoma. Oncol Res. 2020, IF=5.574.

【研究內(nèi)容】：本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織和細胞中MafF（一種轉(zhuǎn)錄因子）的表達較低。慢病毒介導(dǎo)的MafF過表達抑制HCC細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。生物信息學(xué)分析和熒光素酶實驗確定了MafF是miR-224-5p的直接靶點。RNA pull down實驗表明，circ-ITCH可作為miR-224-5p海綿發(fā)揮作用。基因表達/回復(fù)實驗進一步闡明，MafF的表達和抗腫瘤作用可通過circ-ITCH/miR-224-5p軸調(diào)節(jié)。本研究證實了MafF在HCC中的抑癌作用，揭示了MafF的上游調(diào)控機制，為HCC的潛在治療靶點提供了新的視角。

使用技術(shù)：過表達慢病毒載體構(gòu)建、慢病毒包裝、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建

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Ma H.H. et al: Pharmacological Properties of the Type 1 Tyramine Receptor in the Diamondback Moth, Plutella xylostella. Int J Mol Sci. 2019, IF=5.923.

【研究內(nèi)容】：酪胺受體（TAR）可被酪胺（TA）或章魚胺（OA）激活，并已被證明與多種昆蟲的生理調(diào)節(jié)（如味覺反應(yīng)、社會組織和學(xué)習(xí)行為）有關(guān)。作者在小菜蛾中新克隆得到一個酪胺受體基因Pxtar1，并在293T細胞中利用慢病毒進行了該基因的穩(wěn)定表達，功能實驗也顯示酪胺可以激活PxTAR1受體，此外，作者還調(diào)查了Pxtar1在小菜蛾體內(nèi)的表達模式。

使用技術(shù)：過表達慢病毒載體構(gòu)建檢測、慢病毒包裝技術(shù)服務(wù)、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建實驗

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He S.L. et al: FAM3B promotes progression of oesophageal carcinoma via regulating the AKT–MDM2–p53 signalling axis and the epithelial‐mesenchymal transition. J Cell Mol Med. 2019, IF=5.31.

【研究內(nèi)容】：本研究發(fā)現(xiàn)FAM3B在人食管鱗狀細胞癌（ESCC）組織中高表達，且與患者不良預(yù)后有相關(guān)性。慢病毒介導(dǎo)的FAM3B過表達抑制ESCC細胞凋亡，促進ESCC細胞遷移和侵襲。進一步研究證實，F(xiàn)AM3B調(diào)節(jié)AKT-MDM2-p53通路和EMT的兩個核心標記物Snail和E-鈣粘蛋白。這些發(fā)現(xiàn)提示FAM3B可能是ESCC的一個有希望的分子靶點和診斷標記物。

使用技術(shù)：慢病毒載體構(gòu)建技術(shù)、慢病毒包裝外包服務(wù)、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建實驗

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Sun H. et al: The FEN1 L209P mutation interferes with long-patch base excision repair and induces cellular transformation. Oncogene. 2016, IF=9.867

【研究內(nèi)容】：FEN1是一種含特殊結(jié)構(gòu)的核酸酶，對維持人基因組的穩(wěn)定性中有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)了與直腸癌相關(guān)的新FEN1突變，L209P。該突變?nèi)狈EN1的側(cè)翼內(nèi)切酶活性、外切酶活性及缺口內(nèi)切酶活性，但保留了DNA結(jié)合特性。體內(nèi)和體外的基因表達實驗表明，L209P突變能干擾野生型FEN1的功能，且對基因損傷更敏感，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)基因組的不穩(wěn)定和細胞轉(zhuǎn)化。

使用技術(shù)：慢病毒載體構(gòu)建技術(shù)、慢病毒包裝實驗、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建實驗檢測

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