iTRAQ(Isobaric tag for relative and absolute quantitation)是由美國AB SCIEX公司研發(fā)的體外同重同位素標記的定量技術。該技術采用8-plex標記試劑,可以同時比較8組樣本之間的蛋白表達差異。iTRAQ的8種同位素標記試劑由報告基團(113、114、115、116、117、118、119、121)和平衡基團(192、191、190、189 、188、187、186、184 )及肽反應基團組成。不同的報告基團分別與相應的平衡基團相配后,相對分子質(zhì)量均為305,即等量異位標簽。iTRAQ同位素試劑標記多肽氨基基團后,等量混勻多肽并進行LC-MS/MS分析。一級質(zhì)譜中,不同樣品來源的同一肽段表現(xiàn)出相同的質(zhì)荷比;二級質(zhì)譜中,化學鍵斷裂釋放出報告離子,低質(zhì)量區(qū)的報告離子強度反映了該肽段在不同樣品中的相對表達量,高質(zhì)量區(qū)的肽段碎片離子質(zhì)荷比反映了該肽段的序列信息。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索,即可得到樣本中所含蛋白及其表達差異。
iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 技術應用
基礎醫(yī)學:疾病標志物,發(fā)病機制,疾病分型等;
生物醫(yī)藥:藥物機理,藥效評價,藥物開發(fā)等;
農(nóng)林畜漁:抗逆脅迫,生長發(fā)育,耐藥,致病機理等。
iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 輝駿服務優(yōu)勢
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十年服務經(jīng)驗,客戶成果發(fā)表在NatureMethods,Oncogene,Cell Research等高水平期刊上。
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對蛋白篩選與定量方面有獨到見解,擅長針對客戶情況提出合適的方案建議。
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自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執(zhí)行最優(yōu)的實驗路線。
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售后技術支持將一直保持到客戶發(fā)表文章,確保客戶安心進行下游實驗及投稿。
iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 服務信息
項目名稱 | 客戶提供 | 結果交付 | 實驗周期 | 價格 |
iTRAQ | 原始樣本(-80℃保存,干冰運輸) 樣本信息表 分析要求 | 1、蛋白鑒定及定量結果表 | 5-6周 |
iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 分析結果示例
1. Li K. et al: Tyrosine kinase Fyn promotes osteoarthritis by activating the β-catenin pathway. Ann Rheum Dis. 2018,IF=14.299. |
2. Wu X.S. et al: Ubiquitin-specific protease 3 promotes cell migration and invasion by interacting with and deubiquitinating SUZ12 in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2019,IF= 7.068. |
3. Xiao Y.Y. et al: A comprehensive investigation of starch degradation process and identification of a transcriptional activator MabHLH6 during banana fruit ripening. Plant Biotechnol J. 2018,IF=6.84. |
4. Zeng L. et al: Asparagine Synthetase and Filamin A Have Different Roles in Ovarian Cancer. Front Oncol. 2019,IF=4.848. |
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中文標題:酪氨酸激酶Fyn通過激活β-連環(huán)蛋白途徑促進骨關節(jié)炎
發(fā)表期刊:Ann Rheum dis
影響因子:14.299
發(fā)表時間:2018年
合作單位:南方醫(yī)科大學
運用技術:TMT標記定量蛋白質(zhì)組學分析(由輝駿生物提供技術支持)
骨關節(jié)炎(OA)是一種年齡相關性或創(chuàng)傷后退行性關節(jié)疾病,其確切的發(fā)病機制仍不明確。目前OA尚無有效的疾病修飾治療方法,迫切需要開發(fā)新的治療藥物。因此,了解控制軟骨細胞肥大和調(diào)控細胞外基質(zhì)降解相關基因表達的機制對于開發(fā)有效的OA治療方法具有重要意義。
樣本分析證實Fyn在老年小鼠、創(chuàng)傷后骨性關節(jié)炎小鼠和人類骨性關節(jié)炎的關節(jié)軟骨中聚集
基因敲除實驗表明Fyn基因缺失阻止小鼠創(chuàng)傷后和年齡相關骨性關節(jié)炎的發(fā)生
蛋白質(zhì)組學技術證實Fyn與軟骨細胞中的β- catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩(wěn)定
抑制劑治療顯示FYN抑制劑AZD0530和PP1抑β- catenin信號轉(zhuǎn)導并阻止小鼠骨性關節(jié)炎的發(fā)生
研究者首先選取年輕(2個月)和老年(12個月)小鼠的關節(jié)軟骨來識別與軟骨退化有關的蛋白質(zhì)。其中酪氨酸激酶Fyn是老年軟骨中表達最強的蛋白(圖1A)。對4、13和24月齡小鼠的關節(jié)軟骨進行Western blotting分析,證實了老化軟骨中Fyn的顯著增加(圖1B),F(xiàn)yn的積累伴隨著老年小鼠軟骨的退化和OARSI分級的增加(圖1C,D)。為了確定Fyn在人OA關節(jié)軟骨中的表達是否升高,研究者比較了接受過全膝關節(jié)置換術的老年OA患者(年齡67.00±3.03歲)軟骨和無關節(jié)炎病史的年輕交通事故患者(30.25±8.18歲)的正常軟骨中Fyn的表達。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),老年組和OA組軟骨細胞中Fyn水平明顯升高,同時OA組軟骨結構發(fā)生變性和丟失(圖1E,F(xiàn))。這些結果表明,Src激酶家族成員Fyn在老年小鼠和OA患者的退變和損傷的關節(jié)軟骨中聚集。
圖1
為了確定Fyn在退變或受損軟骨的關節(jié)軟骨細胞中積聚的意義,研究者進行了Fyn基因敲除實驗。Western blotting分析顯示了8周齡小鼠軟骨中Fyn基因的缺失(圖2A,B)。與對照組相比,基因敲除組(Fyn-KO小鼠)關節(jié)軟骨或生長板的形態(tài)和組織均沒有明顯差異,這表明Fyn基因的缺失沒有引起小鼠骨骼發(fā)育異常。與對照組相比,F(xiàn)yn-KO組小鼠的軟骨中的蛋白質(zhì)含量顯著減少,TUNEL染色顯示Fyn-KO小鼠關節(jié)軟骨細胞凋亡明顯減少(圖2G),軟骨降解程度有所降低。這些結果表明,F(xiàn)yn的缺失有效地阻止了小鼠創(chuàng)傷后和年齡依賴性OA的發(fā)展。
圖2
為了探討Fyn促進OA發(fā)生的機制,研究者通過蛋白質(zhì)組學的方法對軟骨前體細胞系ATDC5中與Fyn相互作用的蛋白進行了鑒定,在純化的復合物中發(fā)現(xiàn)β-catenin可能是FYN的潛在互作伙伴(圖3A)。IP分析證實β-catenin與Fyn在ATDC5細胞(圖3B)、原代軟骨細胞和軟骨組織中存在相互作用。β-catenin和Fyn的雙重染色也顯示β-catenin與Fyn在ATDC5細胞中共定位(圖3C)。為了確定Fyn是否磷酸化軟骨細胞中的β-catenin,研究者在ATDC5細胞中進行了體外Fyn激酶檢測。結果顯示,F(xiàn)yn免疫沉淀使β-catenin在體外Tyr142處磷酸化,這種磷酸化被Fyn激酶抑制劑PP1或AZD0530抑制(圖3D)。此外,β-catenin及其磷酸化(Tyr142)的表達通過Fyn SiRNA被顯著下調(diào)(圖3E),但在ATDC5細胞中通過Fyn編碼質(zhì)粒的Fyn過表達而增強(圖3F)。為了驗證Fyn在β-catenin信號通路中的關鍵作用,研究者在ATDC5細胞中檢測了鈣粘附素-catenin復合體的形成。PP1對Fyn的抑制或siRNA下調(diào)Fyn的表達可以穩(wěn)定鈣粘連蛋白-連環(huán)蛋白復合體,而Fyn的過度表達則破壞了該復合體(圖3H)。這些數(shù)據(jù)表明,F(xiàn)yn與β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩(wěn)定,導致軟骨細胞中鈣粘連蛋白-catenin復合體的解離。
圖3
在Fyn和β-catenin的雙重染色中發(fā)現(xiàn),隨著Fyn水平的增加,β-catenin從細胞膜轉(zhuǎn)移到了細胞核(圖4A)。用促炎因子白細胞介素1β(IL-1β)處理ATDC5細胞,誘導Fyn和β-catenin在細胞漿和細胞核中的積聚(圖4B),并增加Fyn的表達和磷酸化水平(Tyr416),β-catenin的表達和磷酸化水平(Tyr142),以及MMP13的表達(圖4C)。接下來,研究者評估了老年小鼠和創(chuàng)傷后OA小鼠軟骨中β-catenin及其磷酸化的水平。結果顯示,β-catenin及其磷酸化水平隨著年齡的增長和OA的加重而增加(圖4D)。此外,創(chuàng)傷后FYN-KO小鼠關節(jié)軟骨細胞中的β-catenin水平及其核定位明顯低于對照組(圖4F)。WNT3a是典型的Wnt/β-catenin途徑的激活劑。Fyn的敲除實驗顯示,在OA的發(fā)生發(fā)展過程中,F(xiàn)yn激活了不依賴Wnt信號的β-catenin通路,并增強了β-catenin在關節(jié)軟骨細胞中的核轉(zhuǎn)位。關節(jié)注射icg-001明顯減少了軟骨損傷,維持了關節(jié)軟骨中蛋白多糖的含量,并降低了OA發(fā)生過程中的關節(jié)炎分級,退變軟骨中MMP13和ADAMTS5的表達水平也相應降低。這些結果表明,β-catenin通路參與了Fyn刺激軟骨細胞MMP13和ADAMTS5的表達以及小鼠OA的發(fā)生與發(fā)展。
圖4
為了研究Fyn作為OA治療靶點的潛在用途,研究者檢測了Fyn的化學抑制劑在OA的發(fā)病和進展中的作用。AZD0530和PP1是Src激酶(包括Fyn)的選擇性抑制劑,可用于癌癥的治療。注射小鼠后,與賦形劑治療的小鼠相比,AZD0530和PP1治療顯著減少了軟骨的破壞(圖5A)、OARSI分級(圖5B)和滑膜炎癥,MMP13、ADAMTS5和X膠原含量、TUNEL陽性軟骨細胞數(shù)和骨鈣素表達也顯著減少(圖5C,D)。這些結果表明,抑制Fyn激酶活性可以阻止小鼠創(chuàng)傷后骨性關節(jié)炎的發(fā)生。Western blotting顯示AZD0530或PP1可阻斷IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上調(diào),并抑制p-β-catenin(Tyr142)的增加(圖5E)。接下來,研究者檢測了用或不用AZD0530或PP1AZD0530或PP1治療的創(chuàng)傷后OA小鼠的軟骨樣本中p-β-catenin(Tyr142)的表達。結果顯示,AZD0530和PP1處理的小鼠,MMP13、p-FYN和p-β-catenin(Tyr142)的表達均明顯降低(圖5F)。此外,用AZD0530或PP1治療OA時,F(xiàn)yn和β-catenin在軟骨細胞核中的共存也被取消(圖5G)。這些結果表明,AZD0530和PP1通過抑制FYN誘導的磷酸化β-catenin的表達來預防OA的發(fā)生。
圖5
iTRAQ及TMT等標記定量蛋白質(zhì)組技術有什么特點?
iTRAQ以及TMT等標記定量蛋白質(zhì)組技術分辨率高,細胞樣品最多可鑒定超過6000個蛋白,并且絕大多數(shù)蛋白都有定量和定性信息;其次是通量高,可以一次最多完成8個(iTRAQ)或者10個(TMT)樣品的實驗,特別適合于多組樣品間的同時比較以及生物學過程的動態(tài)檢測。
沒有全基因組數(shù)據(jù)的物種該如何進行蛋白的鑒定?
對于已經(jīng)公布全基因組序列的物種,可以在得到全序列后構建本地建庫并進行本地檢索;對于未進行全基因組測序的物種,可以采用近緣物種的數(shù)據(jù)庫或者EST數(shù)據(jù)以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行檢索。
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