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服務介紹應用案例常見問答

iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 技術原理


iTRAQ(Isobaric tag for relative and absolute quantitation)是由美國AB SCIEX公司研發(fā)的體外同重同位素標記的定量技術。該技術采用8-plex標記試劑,可以同時比較8組樣本之間的蛋白表達差異。iTRAQ的8種同位素標記試劑由報告基團(113、114、115、116、117、118、119、121)和平衡基團(192、191、190、189 、188、187、186、184 )及肽反應基團組成。不同的報告基團分別與相應的平衡基團相配后,相對分子質(zhì)量均為305,即等量異位標簽。iTRAQ同位素試劑標記多肽氨基基團后,等量混勻多肽并進行LC-MS/MS分析。一級質(zhì)譜中,不同樣品來源的同一肽段表現(xiàn)出相同的質(zhì)荷比;二級質(zhì)譜中,化學鍵斷裂釋放出報告離子,低質(zhì)量區(qū)的報告離子強度反映了該肽段在不同樣品中的相對表達量,高質(zhì)量區(qū)的肽段碎片離子質(zhì)荷比反映了該肽段的序列信息。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索,即可得到樣本中所含蛋白及其表達差異。




iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 實驗流程


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iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 技術應用


基礎醫(yī)學:疾病標志物,發(fā)病機制,疾病分型等;

生物醫(yī)藥:藥物機理,藥效評價,藥物開發(fā)等;

農(nóng)林畜漁:抗逆脅迫,生長發(fā)育,耐藥,致病機理等。





iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 輝駿服務優(yōu)勢


1

十年服務經(jīng)驗,客戶成果發(fā)表在NatureMethods,Oncogene,Cell Research等高水平期刊上。

2

對蛋白篩選與定量方面有獨到見解,擅長針對客戶情況提出合適的方案建議。


3

自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執(zhí)行最優(yōu)的實驗路線。


4

售后技術支持將一直保持到客戶發(fā)表文章,確保客戶安心進行下游實驗及投稿。



聯(lián)系技術支持 
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iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 服務信息


項目名稱

客戶提供

結果交付

實驗周期

價格

iTRAQ

原始樣本(-80℃保存,干冰運輸)
樣本信息表
分析要求

 1、蛋白鑒定及定量結果表
 2、肽段鑒定及定量結果表
 3、差異蛋白結果表
 4、生物信息學分析結果
 5、質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)
 6、實驗報告

5-6周


點擊詢價







iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 分析結果示例




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聯(lián)系技術支持 
18927549347



iTRAQ蛋白質(zhì)組學 * 客戶文獻


1. Li K. et al: Tyrosine kinase Fyn promotes osteoarthritis by activating the β-catenin pathway. Ann Rheum Dis. 2018,IF=14.299.
【研究內(nèi)容】:骨關節(jié)炎和軟骨退變過程中,WNT/β-catenin被激活的機制尚未完全明確,本研究利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學技術,篩選了年輕(2月齡)和老齡(12月齡)小鼠的蛋白表達差異,并發(fā)現(xiàn)一種在老年軟骨中強烈上調(diào)的蛋白——酪氨酸激酶Fyn。為了探究Fyn促進骨關節(jié)炎發(fā)展的機制,客戶將免疫沉淀(IP)與蛋白質(zhì)組學分析相結合,最終證明酪氨酸激酶Fyn可以通過激活β-catenin通路促進關節(jié)炎,為骨關節(jié)炎提供了一個新的治療靶點。
使用技術:iTRAQ蛋白質(zhì)組學分析、iTraq實驗外包服務


2. Wu X.S. et al: Ubiquitin-specific protease 3 promotes cell migration and invasion by interacting with and deubiquitinating SUZ12 in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2019,IF= 7.068.
【研究內(nèi)容】:泛素特異性蛋白酶3 (USP3) 的異常表達可能在腫瘤發(fā)展中起重要作用,然而其促進胃癌轉(zhuǎn)移的機制尚不明確。本研究利用itraq蛋白質(zhì)組學技術鑒定了USP3過表達胃癌細胞與對照細胞之間差異表達的蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)SUZ12對于USP3介導的胃癌活性是不可或缺的,USP3結合SUZ12,去泛素化SUZ12并使其穩(wěn)定。SUZ12敲除抑制USP3誘導的遷移、侵襲和EMT。結果表明USP3-SUZ12信號通路促進胃癌發(fā)展。  
使用技術:itraq定量實驗、itraq定量蛋白組學檢測


3. Xiao Y.Y. et al: A comprehensive investigation of starch degradation process and identification of a transcriptional activator MabHLH6 during banana fruit ripening. Plant Biotechnol J. 2018,IF=6.84.
【研究內(nèi)容】:本研究探討了淀粉水果“香蕉”在成熟過程中的淀粉降解機制。研究者基于iTRAQ的蛋白質(zhì)組學實驗鑒定了18種與淀粉顆粒表面結合的淀粉降解相關酶,其中10種在成熟過程中顯著上調(diào)。酵母單雜交、電泳遷移率分析、ChIP等實驗進一步表明,香蕉果實成熟過程中的淀粉降解,可能歸因于轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上與淀粉分解相關的許多酶的復雜作用,MabHLH6可能通過直接激活一系列淀粉降解相關基因而作為該過程的積極調(diào)節(jié)者。
使用技術:蛋白質(zhì)組 iTRAQ、蛋白質(zhì)組學itraq


4. Zeng L. et al: Asparagine Synthetase and Filamin A Have Different Roles in Ovarian Cancer. Front Oncol. 2019,IF=4.848.
【研究內(nèi)容】:臨床上早期卵巢漿液性癌較難發(fā)現(xiàn),而高級別漿液性癌(HGSC)和低級別漿液性癌(LGSC)的蛋白表達譜將為診斷和化療提供重要信息。研究者通過iTRAQ技術對13例HGSC和7例LGSC患者的標本進行了蛋白質(zhì)組學分析,共鑒定出323個差異表達的蛋白質(zhì)。IHC驗證后,選擇天冬酰胺合成酶(ASNS)和細絲蛋白A(FLNA)進行進一步的功能研究。體內(nèi)和體外實驗結果表明,ASNS和FLNA是HGSC和LGSC的不同的生物標志物,可能對漿液性癌的預后和臨床治療有潛在的價值。
使用技術:itraq分析、itraq差異蛋白實驗





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中文標題:酪氨酸激酶Fyn通過激活β-連環(huán)蛋白途徑促進骨關節(jié)炎

發(fā)表期刊:Ann Rheum dis

影響因子:14.299

發(fā)表時間:2018年

合作單位:南方醫(yī)科大

運用技術TMT標記定量蛋白質(zhì)組學分析(由輝駿生物提供技術支持)




● 研究背景


骨關節(jié)炎(OA)是一種年齡相關性或創(chuàng)傷后退行性關節(jié)疾病,其確切的發(fā)病機制仍不明確。目前OA尚無有效的疾病修飾治療方法,迫切需要開發(fā)新的治療藥物。因此,了解控制軟骨細胞肥大和調(diào)控細胞外基質(zhì)降解相關基因表達的機制對于開發(fā)有效的OA治療方法具有重要意義。




● 研究路線


1
2

樣本分析證實Fyn在老年小鼠、創(chuàng)傷后骨性關節(jié)炎小鼠和人類骨性關節(jié)炎的關節(jié)軟骨中聚集

基因敲除實驗表明Fyn基因缺失阻止小鼠創(chuàng)傷后和年齡相關骨性關節(jié)炎的發(fā)生

3
4

蛋白質(zhì)組學技術證實Fyn與軟骨細胞中的β- catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩(wěn)定

抑制劑治療顯示FYN抑制劑AZD0530和PP1抑β- catenin信號轉(zhuǎn)導并阻止小鼠骨性關節(jié)炎的發(fā)生





● 研究結果


1. Fyn在老年小鼠、創(chuàng)傷后骨性關節(jié)炎小鼠和人類骨性關節(jié)炎的關節(jié)軟骨中聚集


研究者首先選取年輕(2個月)和老年(12個月)小鼠的關節(jié)軟骨來識別與軟骨退化有關的蛋白質(zhì)。其中酪氨酸激酶Fyn是老年軟骨中表達最強的蛋白(圖1A)。對4、13和24月齡小鼠的關節(jié)軟骨進行Western blotting分析,證實了老化軟骨中Fyn的顯著增加(圖1B),F(xiàn)yn的積累伴隨著老年小鼠軟骨的退化和OARSI分級的增加(圖1C,D)。為了確定Fyn在人OA關節(jié)軟骨中的表達是否升高,研究者比較了接受過全膝關節(jié)置換術的老年OA患者(年齡67.00±3.03歲)軟骨和無關節(jié)炎病史的年輕交通事故患者(30.25±8.18歲)的正常軟骨中Fyn的表達。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),老年組和OA組軟骨細胞中Fyn水平明顯升高,同時OA組軟骨結構發(fā)生變性和丟失(圖1E,F(xiàn))。這些結果表明,Src激酶家族成員Fyn在老年小鼠和OA患者的退變和損傷的關節(jié)軟骨中聚集。

iTRAQ蛋白質(zhì)組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖1



2. Fyn基因缺失阻止小鼠創(chuàng)傷后和衰老相關OA的發(fā)生 

  

為了確定Fyn在退變或受損軟骨的關節(jié)軟骨細胞中積聚的意義,研究者進行了Fyn基因敲除實驗。Western blotting分析顯示了8周齡小鼠軟骨中Fyn基因的缺失(圖2A,B)。與對照組相比,基因敲除組(Fyn-KO小鼠)關節(jié)軟骨或生長板的形態(tài)和組織均沒有明顯差異,這表明Fyn基因的缺失沒有引起小鼠骨骼發(fā)育異常。與對照組相比,F(xiàn)yn-KO組小鼠的軟骨中的蛋白質(zhì)含量顯著減少,TUNEL染色顯示Fyn-KO小鼠關節(jié)軟骨細胞凋亡明顯減少(圖2G),軟骨降解程度有所降低。這些結果表明,F(xiàn)yn的缺失有效地阻止了小鼠創(chuàng)傷后和年齡依賴性OA的發(fā)展。

iTRAQ蛋白質(zhì)組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖2



3. Fyn與軟骨細胞中的β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩(wěn)定


為了探討Fyn促進OA發(fā)生的機制,研究者通過蛋白質(zhì)組學的方法對軟骨前體細胞系ATDC5中與Fyn相互作用的蛋白進行了鑒定,在純化的復合物中發(fā)現(xiàn)β-catenin可能是FYN的潛在互作伙伴(圖3A)。IP分析證實β-catenin與Fyn在ATDC5細胞(圖3B)、原代軟骨細胞和軟骨組織中存在相互作用。β-catenin和Fyn的雙重染色也顯示β-catenin與Fyn在ATDC5細胞中共定位(圖3C)。為了確定Fyn是否磷酸化軟骨細胞中的β-catenin,研究者在ATDC5細胞中進行了體外Fyn激酶檢測。結果顯示,F(xiàn)yn免疫沉淀使β-catenin在體外Tyr142處磷酸化,這種磷酸化被Fyn激酶抑制劑PP1或AZD0530抑制(圖3D)。此外,β-catenin及其磷酸化(Tyr142)的表達通過Fyn SiRNA被顯著下調(diào)(圖3E),但在ATDC5細胞中通過Fyn編碼質(zhì)粒的Fyn過表達而增強(圖3F)。為了驗證Fyn在β-catenin信號通路中的關鍵作用,研究者在ATDC5細胞中檢測了鈣粘附素-catenin復合體的形成。PP1對Fyn的抑制或siRNA下調(diào)Fyn的表達可以穩(wěn)定鈣粘連蛋白-連環(huán)蛋白復合體,而Fyn的過度表達則破壞了該復合體(圖3H)。這些數(shù)據(jù)表明,F(xiàn)yn與β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩(wěn)定,導致軟骨細胞中鈣粘連蛋白-catenin復合體的解離。

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圖3



4. Fyn激活β-catenin途徑促進OA的發(fā)生


在Fyn和β-catenin的雙重染色中發(fā)現(xiàn),隨著Fyn水平的增加,β-catenin從細胞膜轉(zhuǎn)移到了細胞核(圖4A)。用促炎因子白細胞介素1β(IL-1β)處理ATDC5細胞,誘導Fyn和β-catenin在細胞漿和細胞核中的積聚(圖4B),并增加Fyn的表達和磷酸化水平(Tyr416),β-catenin的表達和磷酸化水平(Tyr142),以及MMP13的表達(圖4C)。接下來,研究者評估了老年小鼠和創(chuàng)傷后OA小鼠軟骨中β-catenin及其磷酸化的水平。結果顯示,β-catenin及其磷酸化水平隨著年齡的增長和OA的加重而增加(圖4D)。此外,創(chuàng)傷后FYN-KO小鼠關節(jié)軟骨細胞中的β-catenin水平及其核定位明顯低于對照組(圖4F)。WNT3a是典型的Wnt/β-catenin途徑的激活劑。Fyn的敲除實驗顯示,在OA的發(fā)生發(fā)展過程中,F(xiàn)yn激活了不依賴Wnt信號的β-catenin通路,并增強了β-catenin在關節(jié)軟骨細胞中的核轉(zhuǎn)位。關節(jié)注射icg-001明顯減少了軟骨損傷,維持了關節(jié)軟骨中蛋白多糖的含量,并降低了OA發(fā)生過程中的關節(jié)炎分級,退變軟骨中MMP13和ADAMTS5的表達水平也相應降低。這些結果表明,β-catenin通路參與了Fyn刺激軟骨細胞MMP13和ADAMTS5的表達以及小鼠OA的發(fā)生與發(fā)展。

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圖4



5. FYN抑制劑AZD0530和PP1抑制β-catenin信號轉(zhuǎn)導并阻止小鼠骨性關節(jié)炎的發(fā)生

   

為了研究Fyn作為OA治療靶點的潛在用途,研究者檢測了Fyn的化學抑制劑在OA的發(fā)病和進展中的作用。AZD0530和PP1是Src激酶(包括Fyn)的選擇性抑制劑,可用于癌癥的治療。注射小鼠后,與賦形劑治療的小鼠相比,AZD0530和PP1治療顯著減少了軟骨的破壞(圖5A)、OARSI分級(圖5B)和滑膜炎癥,MMP13、ADAMTS5和X膠原含量、TUNEL陽性軟骨細胞數(shù)和骨鈣素表達也顯著減少(圖5C,D)。這些結果表明,抑制Fyn激酶活性可以阻止小鼠創(chuàng)傷后骨性關節(jié)炎的發(fā)生。Western blotting顯示AZD0530或PP1可阻斷IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上調(diào),并抑制p-β-catenin(Tyr142)的增加(圖5E)。接下來,研究者檢測了用或不用AZD0530或PP1AZD0530或PP1治療的創(chuàng)傷后OA小鼠的軟骨樣本中p-β-catenin(Tyr142)的表達。結果顯示,AZD0530和PP1處理的小鼠,MMP13、p-FYN和p-β-catenin(Tyr142)的表達均明顯降低(圖5F)。此外,用AZD0530或PP1治療OA時,F(xiàn)yn和β-catenin在軟骨細胞核中的共存也被取消(圖5G)。這些結果表明,AZD0530和PP1通過抑制FYN誘導的磷酸化β-catenin的表達來預防OA的發(fā)生。

iTRAQ蛋白質(zhì)組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖5



Q:

iTRAQ及TMT等標記定量蛋白質(zhì)組技術有什么特點?

A:

iTRAQ以及TMT等標記定量蛋白質(zhì)組技術分辨率高,細胞樣品最多可鑒定超過6000個蛋白,并且絕大多數(shù)蛋白都有定量和定性信息;其次是通量高,可以一次最多完成8個(iTRAQ)或者10個(TMT)樣品的實驗,特別適合于多組樣品間的同時比較以及生物學過程的動態(tài)檢測。


Q:

沒有全基因組數(shù)據(jù)的物種該如何進行蛋白的鑒定?

A:

對于已經(jīng)公布全基因組序列的物種,可以在得到全序列后構建本地建庫并進行本地檢索;對于未進行全基因組測序的物種,可以采用近緣物種的數(shù)據(jù)庫或者EST數(shù)據(jù)以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行檢索。



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