Label-free是一種非標記的定量蛋白質組學技術，不需使用同位素標簽做內部標準，直接根據肽段質譜峰的強度對蛋白進行相對定量。

不同樣本提取的蛋白質進行定量，取等量蛋白分別進行胰酶酶解，之后純化的各組肽段分別做LC-MS/MS分析；采用特定軟件檢索原始質譜數(shù)據，解析出不同樣本中各個肽段的定量信息，進而獲得蛋白質在不同樣本中的定性和定量信息

1、蛋白鑒定和定量；
2、差異蛋白的篩選和鑒定。

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1.Hervé V. et al:Large-Scale Proteomics of the Cassava Storage Root and Identification of a Target Gene to Reduce Postharvest Deterioration. The Plant Cell.2014，IF=9.618. 【研究內容】：木薯是熱帶地區(qū)最重要的塊根作物，但木薯采后生理快速退化（PPD）是制約木薯商品化生產的主要原因。研究者建立了一種基于圖像的PPD癥狀量化方法，并使用Label Free非標記定量蛋白質組學方法，在木薯根中鑒定出2600多個獨特的蛋白質，其中近300個蛋白質在PPD過程中表現(xiàn)出顯著的豐度調節(jié)?；诘鞍踪|組學數(shù)據、酶活性和脂質過氧化檢測，最終確定谷胱甘肽過氧化物酶是降低PPD的候選藥物。 使用技術：label free定量蛋白組分析、Label-free實驗外包服務

2.Brian D.et al:Large-Scale Label-Free Comparative Proteomics Analysis of Polo-Like Kinase 1 Inhibition via the Small-Molecule Inhibitor BI 6727(Volasertib) in BRAF V600E Mutant Melanoma Cells. Journal of Proteome Research.2015，IF=4.074. 【研究內容】：Polo-like kinase1(Plk1)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種人類癌癥中過表達，對持續(xù)的致癌增殖至關重要。為了更好地了解Plk1信號轉導機制，研究者利用Label Free非標記定量蛋白質組學方法，發(fā)現(xiàn)Plk1特異性抑制劑BI 6727處理人黑色素瘤A375細胞后，多個蛋白的表達發(fā)生了變化。此外，研究者還通過異質核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)確定了Plk1和p53之間的新關聯(lián)，從而為Plk1在癌細胞存活中的作用提供了有價值的見解。 使用技術：label-free 質譜、Label free非標定量蛋白質組學、LabelFree定量實驗檢測

蛋白組/代謝組實驗

? iTRAQ 定量蛋白質組學

? Label Free 實驗檢測服務

? LC-MS/MS 蛋白質譜鑒定

? DIA 全息掃描定量蛋白質
? 廣泛靶向代謝組學

蛋白/核酸相互作用實驗

? GST pull down

? RNA pull down

? DNA pull down

? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯(lián)親和純化

分子細胞生物學實驗

? 基因調取/合成 (cDNA克隆)

?熒光定量PCR (qPCR)

? 載體構建實驗服務

?miRNA靶基因驗證
? 慢病毒包裝

科研產品

? 哺乳動物細胞表達載體

? 人cDNA克隆庫

? 慢病毒表達載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務

? 單克隆抗體測序

? 抗體從頭測序

? 抗體表達服務

? 重組抗體表達

實驗試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

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中文標題：小分子抑制劑BI 6727對BRAFV600E突變黑色素瘤細胞Polo樣激酶1抑制作用的大規(guī)模非標記比較蛋白質組學分析

發(fā)表期刊：Journal of proteome research

影響因子：4.074

運用技術：Label Free非標定量蛋白質組學 （由輝駿生物提供技術支持）

● 內容概述

Polo-like kinase1(Plk1)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過調節(jié)有絲分裂的進入、進展和退出，在多種人類癌癥中過表達，對持續(xù)的致癌增殖至關重要。本研究通過利用定量蛋白質組學策略來比較Plk1特異性抑制劑BI 6727處理后BRAFV600E突變黑色素瘤細胞的蛋白質組，利用無標記納米LC?MS/MS技術在Q-Exactive上進行篩選，鑒定了20多個感興趣的蛋白；并通過乳酸和NAD水平來評估與細胞代謝相關的降低。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)了多個蛋白酶體亞基的下調，導致20S蛋白酶體活性顯著降低。有關異質核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)的檢測也進一步確定了Plk1和p53之間的新關聯(lián)，從而為Plk1在癌細胞存活中的作用提供了有價值的見解。

● 研究路線

● 研究結果

1. BI 6727處理、蛋白質鑒定、定量和分析

為確定Plk1在黑色素瘤中的下游分子機制，研究者闡明了BI 6727抑制Plk1后人黑色素瘤細胞蛋白質組的定量變化。使用Label Free方法進行分析，為準確確定蛋白質比例，每種樣本類型設置了三個以上的實驗重復。該方法識別出1800多種蛋白質，其中343種被識別的蛋白質表現(xiàn)出顯著的表達變化。

接下來，研究者使用Panther(通過進化關系進行蛋白質分析)來評估集體蛋白質的分子功能，并確定催化活性和結合是主要的蛋白質功能(圖2C)。

2. BI 6727治療改變多種代謝蛋白的表達

蛋白質組學分析結果表明，Plk1活性的抑制導致多種代謝蛋白的表達減少，包括蘋果酸脫氫酶1(MDH1)、谷草轉氨酶2(GOT2)和轉酮醇酶(TKT)。此外，Western blot結果證實了乳酸脫氫酶A(LDHA)、葡萄糖-6-磷酸異構酶(GPI)和乳酸脫氫酶B(LDHB)顯著降低(圖3A)。有趣的是，LDHA、LDHB和GPI均在糖酵解中扮演著重要的角色。推測Plk1的過表達可能有助于癌癥相關的從線粒體氧化磷酸化OXPHOS向有氧糖酵解的轉換。

為了評估Plk1抑制對有氧糖酵解的影響，研究者分別測量了細胞外乳酸的水平，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的水平，乳酸是葡萄糖分解的主要副產品，而NADH和NADPH是糖酵解和磷酸戊糖途徑分解葡萄糖過程中產生的酶輔助因子。結果顯示兩個治療組(25 NM和100 NM)的乳酸水平與對照組相比顯著降低(圖3C)。在BI-6727處理的細胞中，NADH和NADPH水平顯著降低，幾乎降低了5倍(圖3D)。這些數(shù)據表明，Plk1抑制后NAD+的下降幅度更大，鑒于丙酮酸到乳酸的轉化是NAD+再生的主要途徑，有理由預測LDHA的下降是比率變化的主要因素。

3. BI 6727治療導致多個20S蛋白酶體亞基下調

 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過一個系統(tǒng)過程對細胞內80%~90%的蛋白質降解起著不可或缺的作用。在比較蛋白質組學分析中，研究者發(fā)現(xiàn)BI6727治療導致人黑色素瘤細胞中多個20S亞基的顯著下調。進一步擴大IPA分析范圍，發(fā)現(xiàn)20S亞基α7和β6分別下調了2.46%和5.56%(圖4B)。使用熒光團標記的蛋白酶體底物檢測了20S蛋白酶體的活性，檢測顯示，與對照組相比，BI 6727處理細胞的20S活性顯著降低(圖4D)。

4. 異質性核糖核蛋白C1/C2在BI 6727治療后上調

異質性核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)是一種普遍存在的RNA結合蛋白，主要以hnRNPC1和hnRNPC2兩種異構體表達。最近的一項研究表明，HNRNPC過表達通過抑制有絲分裂蛋白極光激酶B(AurkB)在肝細胞癌(HCC)細胞中誘導微核。Plk1活性的抑制可能會對AurkB的表達產生負面影響，與Plk1抑制相關的有絲分裂可能部分通過HNRNPC和AurkB介導。此外，HNRNPC被證明通過直接與p53 mRNA 5‘編碼區(qū)的順式元件結合來促進p53的翻譯。研究者分別通過Western blot和p21的轉錄分析發(fā)現(xiàn)p53蛋白的表達和活性相應地增加(圖5E)。這些數(shù)據為Plk1通過調節(jié)HNRNPC介導的p53表達提供了令人信服的證據。

● 結論

對BI 6727抑制人黑色素瘤A375細胞Plk1的蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，多個蛋白的表達發(fā)生了變化，這些蛋白尚未被確定為Plk1信號網絡的一部分。蛋白質組學分析提供了Plk1和HNRNPC之間一種新的關系的證據，并且Plk1抑制對厭氧糖酵解和蛋白酶體活性有相當大的影響，這兩條途徑是癌細胞生存所必需的。這些數(shù)據為新的Plk1信號通路和未來靶向治療的潛在候選者提供了堅實的基礎。