RNA免疫沉淀（RIP）* 實(shí)驗(yàn)原理

RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀）是研究體內(nèi) RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。

結(jié)合了抗體的磁珠或樹脂（Beads）與樣本裂解液孵育，通過”抗原-抗體“之間的免疫作用，誘餌蛋白被吸附在Beads上，與誘餌蛋白結(jié)合的RNA，也一起沉淀到Beads上。洗滌去掉未結(jié)合的RNA后，再用洗脫液將RNA-蛋白復(fù)合物從Beads洗脫下來，便得到RNA免疫沉淀產(chǎn)物。RIP產(chǎn)物既可以用qPCR檢測(cè)已知RNA，也可以用二代測(cè)序檢測(cè)未知RNA。

當(dāng)沒有合適的誘餌蛋白抗體時(shí)，可以通過表達(dá)融合了flag標(biāo)簽的誘餌蛋白，利用flag標(biāo)簽做免疫沉淀。即細(xì)胞過表達(dá)Flag-Bait，經(jīng)裂解后與anti-Flag珠子孵育，誘餌融合蛋白與Beads結(jié)合，與誘餌融合蛋白互作的RNA“共沉淀”到Beads上，再經(jīng)洗滌、洗脫后做qPCR或NGS測(cè)序。

RNA免疫沉淀（RIP）* 實(shí)驗(yàn)流程

內(nèi)源蛋白的RNA免疫共沉淀流程圖

標(biāo)簽融合蛋白的RNA免疫共沉淀流程圖

RNA免疫共沉淀（RIP）* 應(yīng)用背景

RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一類功能強(qiáng)大而廣泛的調(diào)節(jié)因子，約占細(xì)胞編碼的所有蛋白的5%~10%。目前除了少數(shù)RNA以核酶形式單獨(dú)發(fā)揮功能，大部分RNA通過與蛋白結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物來發(fā)揮作用。

一方面，RBP參與RNA合成、可變剪接、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯及胞內(nèi)定位等多個(gè)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程，調(diào)控mRNA穩(wěn)定性、lncRNA活性、miRNA沉默復(fù)合體形成等生物學(xué)過程；另一方面，RNA也會(huì)調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的活性、定位或與其他蛋白質(zhì)的相互作用，從而影響RBP介導(dǎo)的各種細(xì)胞事件。RNA與蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是非常重要的，干擾這種相互作用將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)和相關(guān)疾病的發(fā)生。

目前研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用的方法分為兩大類：一是以感興趣的RNA為中心，尋找與該RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)；二是以感興趣的蛋白質(zhì)為中心，尋找與該蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA。RIP（RNA免疫共沉淀）屬于后者，利用特異性的抗體捕獲樣本中的目標(biāo)蛋白，那么與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA也一并被捕獲，之后通過qPCR或者測(cè)序技術(shù)來確定這些結(jié)合的RNA。

聯(lián)系技術(shù)支持

18927549347、13430303037

RNA免疫共沉淀（RIP）* 輝駿服務(wù)內(nèi)容

RNA免疫共沉淀RIP * 樣本要求

▲注意：這里列出的均為每組樣本的送樣量，如果實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組用的樣本一致，此樣本量*2。詳細(xì)送樣指南可聯(lián)系輝駿生物客服或銷售索取。

 保存及運(yùn)輸：-80℃保存，干冰取樣/運(yùn)輸，至少在送樣前2天通知我司。

RNA免疫共沉淀RIP * 結(jié)果示例

RIP-qPCR：誘餌蛋白western blot檢測(cè)圖

RIP-qPCR：待測(cè)基因和內(nèi)參基因檢測(cè)數(shù)據(jù)

RIP組相對(duì)于IgG組的富集圖

聯(lián)系技術(shù)支持

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RNA免疫共沉淀RIP * 客戶服務(wù)案例

Han H. et al: Long noncoding RNA PART1 restrains aggressive gastric cancer through the epigenetic silencing of PDGFB via the PLZF-mediated recruitment of EZH2. 

Oncogene. 2020. (IF=9.867)

lncRNA PART1通過PLZF介導(dǎo)的EZH2募集導(dǎo)致PDGFB表觀遺傳沉默來抑制侵襲性胃癌

研究概述

以往研究顯示，一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)“PART1”在某些癌癥中有抑癌作用，在某些癌癥中又有致癌作用。人類胃癌組織的GEO芯片數(shù)據(jù)顯示，lncRNA PART1在胃癌中顯著下調(diào)，TCGA數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫信息顯示低水平的lncRNA PART1更容易導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和患者生存期縮短；但其臨床意義和潛在機(jī)制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)的PART1新作用機(jī)制是：PART1與AR相互作用，以雄激素非依賴性的模式激活腫瘤抑制因子PLZF，之后PLZF蛋白和EZH2蛋白相互作用，導(dǎo)致PI3K-Akt通路基因PDGFB的啟動(dòng)子發(fā)生H3K27me3修飾，從而使促癌基因PDGFB的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。

研究路線

RNA免疫共沉淀RIP * 客戶文章

1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018，IF=28.467. 【研究?jī)?nèi)容】：輝駿生物為作者單位之一，和作者共同開發(fā)了一種捕獲鑒定新生RNA結(jié)合蛋白的全新方法（RICK）。該方法用EU標(biāo)記新生RNA，通過點(diǎn)擊反應(yīng)-生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)結(jié)合質(zhì)譜分析，分離鑒定RNA互作蛋白。其中，METTL1和CDK1是兩個(gè)RICK獨(dú)有的RNA結(jié)合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了它們與非PolyA RNA的結(jié)合，這種結(jié)合在細(xì)胞分化與增殖中發(fā)揮了重要作用。 使用相關(guān)技術(shù)：RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)

2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9. 【研究?jī)?nèi)容】：客戶利用RNA pull down、CoIP等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21與HNRNPK結(jié)合，并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成復(fù)合物，作者通過RIP-qPCR進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞中存在該復(fù)合物。該復(fù)合物甲基化了多能性基因的啟動(dòng)子序列及相應(yīng)組蛋白，并改變了它們的表達(dá)量，從而進(jìn)一步影響體細(xì)胞重編程過程。 使用相關(guān)技術(shù)：RIP seq、RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀rip qpcr、質(zhì)譜鑒定

3. Zhang C Y . et al: CircVPRBP inhibits nodal metastasis of cervical cancer by impeding RACK1 O-GlcNAcylation and stability. Oncogene. 2023, IF=8.756. 【研究?jī)?nèi)容】：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌（CCa）患者最惡性的臨床特征之一。本研究利用RNA pull down、RIP和Co-IP等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：circVPRBP與OGT酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RACK1蛋白，阻礙RACK1-S122位點(diǎn)的O-GlcNAc修飾來使其降解，從而抑制宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。 使用相關(guān)技術(shù)：RIP-qPCR、RNA pull down MS、免疫共沉淀Co-IP、質(zhì)譜鑒定

輝駿生物RIP（RNA免疫共沉淀）服務(wù)內(nèi)容

1. RIP-qPCR，用于檢測(cè)某樣本中的誘餌蛋白和待測(cè)RNA是否結(jié)合；

2. RIP-seq，用于篩選某樣本中的誘餌蛋白可以結(jié)合哪些RNA。

聯(lián)系技術(shù)支持

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RIP（RNA免疫共沉淀）樣本要求

▲注意：這里列出的均為每組樣本的送樣量，如果實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組用的樣本一致，此樣本量*2。詳細(xì)送樣指南可聯(lián)系輝駿生物客服或銷售索取。

保存及運(yùn)輸：-80℃保存，干冰取樣/運(yùn)輸，至少在送樣前2天通知我司。

RNA免疫共沉淀RIP結(jié)果示例

RIP qPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)

RIP組相對(duì)于input組的富集圖（% input）

RIP組相對(duì)于IgG組的富集圖

聯(lián)系技術(shù)支持

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RIP（RNA免疫共沉淀）服務(wù)優(yōu)勢(shì)*輝駿生物

RIP實(shí)驗(yàn)客戶文章

1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018，IF=28.467. 【研究?jī)?nèi)容】：輝駿生物為作者單位之一，和作者共同開發(fā)了一種捕獲鑒定新生RNA結(jié)合蛋白的全新方法（RICK）。該方法用EU標(biāo)記新生RNA，通過點(diǎn)擊反應(yīng)-生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)結(jié)合質(zhì)譜分析，分離鑒定RNA互作蛋白。其中，METTL1和CDK1是兩個(gè)RICK獨(dú)有的RNA結(jié)合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了它們與非PolyA RNA的結(jié)合，這種結(jié)合在細(xì)胞分化與增殖中發(fā)揮了重要作用。 使用相關(guān)技術(shù)：RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)

2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9. 【研究?jī)?nèi)容】：客戶利用RNA pull down、CoIP等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21與HNRNPK結(jié)合，并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成復(fù)合物，作者通過RIP-qPCR進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞中存在該復(fù)合物。該復(fù)合物甲基化了多能性基因的啟動(dòng)子序列及相應(yīng)組蛋白，并改變了它們的表達(dá)量，從而進(jìn)一步影響體細(xì)胞重編程過程。 使用相關(guān)技術(shù)：RIP seq、RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀rip qpcr、質(zhì)譜鑒定

3. Zhang C Y . et al: CircVPRBP inhibits nodal metastasis of cervical cancer by impeding RACK1 O-GlcNAcylation and stability. Oncogene. 2023, IF=8.756. 【研究?jī)?nèi)容】：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌（CCa）患者最惡性的臨床特征之一。本研究利用RNA pull down、RIP和Co-IP等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：circVPRBP與OGT酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RACK1蛋白，阻礙RACK1-S122位點(diǎn)的O-GlcNAc修飾來使其降解，從而抑制宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。 使用相關(guān)技術(shù)：RIP-qPCR、RNA pull down MS、免疫共沉淀Co-IP、質(zhì)譜鑒定

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RNA免疫共沉淀試劑盒（RIP試劑盒）信息

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RIP試劑盒簡(jiǎn)介

RNA免疫共沉淀（RIP）是采用特異性抗體來調(diào)取內(nèi)源性RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合RNA的技術(shù)。分離出的蛋白可以進(jìn)行western-blot檢測(cè)調(diào)取效果，而提取純化的RNA可以利用qPCR（RIP-qPCR）或利用高通量測(cè)序（RIP-Seq）方法來檢測(cè)。

根據(jù)樣本類型、誘餌蛋白是否攜帶標(biāo)簽，以及beads類型不同，輝駿生物公司開發(fā)了多款RIP試劑盒，可用于分離不同生物樣本提取物中的目標(biāo)蛋白及其結(jié)合RNA。

當(dāng)誘餌蛋白不帶標(biāo)簽時(shí)，可以根據(jù)beads的不同選擇protein G 或Protein A/G RIP試劑盒，當(dāng)誘餌蛋白攜帶標(biāo)簽時(shí)，可以根據(jù)標(biāo)簽種類的不同選擇ChainFree^TM 系列試劑盒，該系列試劑盒采用了優(yōu)化并重組表達(dá)的、無輕重鏈的標(biāo)簽抗體磁珠進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。IP復(fù)合物無論采用非變性洗脫還是變性洗脫，均不會(huì)出現(xiàn)抗體的輕、重鏈污染問題。

RIP試劑盒應(yīng)用

RNA結(jié)合蛋白（RBPs）是可以與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，參與調(diào)控了RNA的眾多生物學(xué)過程。可以說，沒有RBPs，RNA幾乎寸步難行。RIP技術(shù)主要應(yīng)用于驗(yàn)證或?qū)ふ遗c已知RBP結(jié)合的RNA。以下列舉了可應(yīng)用RIP試劑盒的幾個(gè)研究方向：

1. RBPs功能研究，如活性調(diào)控、定位等；

2. RBPs調(diào)控的RNA功能研究，如合成、可變剪切、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位、穩(wěn)定性和翻譯等。

Protein G和ProteinA/G RIP試劑盒-輝駿生物產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1、特殊優(yōu)化的beads與抗體親和效率高，抗體用量少；

2、裂解效率高：優(yōu)化的各裂解液體系分別適用于動(dòng)物、植物或微生物樣本；

3、操作簡(jiǎn)便，周期短，適合初學(xué)者。

4、品質(zhì)好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。

5、洗脫液適配后續(xù)qPCR和高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)。