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His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹脂產(chǎn)品信息

His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹脂以高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法偶聯(lián)四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni2+）后，形成非常穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu)，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結(jié)構(gòu)可保護(hù)鎳離子免受小分子的進(jìn)攻，更加穩(wěn)定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件。該產(chǎn)品可在相對(duì)較高的流速下，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的純化。

His標(biāo)簽蛋白純化樹脂產(chǎn)品屬性

His純化樹脂使用案例

小量蛋白純化操作方法（參考）

 
1. 樣本準(zhǔn)備（以大腸桿菌表達(dá)的蛋白純化為例）
（1）挑取單菌落到含有適合抗性的LB培養(yǎng)基中，根據(jù)載體說明加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間。
（2）表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至離心瓶，7000 rpm，離心15 min，收集菌體，然后加入菌液體積1/10的裂解緩沖液（添加PMSF，終濃度為1 mM），也可同時(shí)加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹脂的結(jié)合。
（3）之后加入溶菌酶，使其工作濃度為1 mg/mL。
注：如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
（4）將菌體沉淀懸浮起來（如果菌液濃度高，可考慮加入10 μg/mL RNase A和5 μg/mL DNase I），混勻，置于冰上超聲破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。
（5）收集上述澄清蛋白液至離心管中，10000 rpm，4℃離心20~30 min。取上清，置于冰上備用或 - 20℃保存。

2. His標(biāo)簽融合蛋白純化
(1)  根據(jù)蛋白表達(dá)量取適量體積的 His純化樹脂至尖底離心管中，加入5倍樹脂體積的漂洗緩沖液，顛倒混勻30次，500 g離心5 min，棄上清。
(2)  重復(fù)漂洗一次，500 g離心5 min，棄上清。
(3)  向樹脂中加入含His融合蛋白的大腸桿菌裂解液（總體積不要超過離心管體積的2/3)，放混勻儀上4 ℃孵育2~4 h。
(4)  4 ℃ 500 g離心5 min，棄上清。
(5)  加入10倍樹脂體積漂洗緩沖液，顛倒混勻30次，4 ℃ 500g離心5 min，棄上清；重復(fù)該漂洗操作兩次，500 g離心5 min，棄上清。

3. 洗脫
(1)  SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫法（變性洗脫法）：得到的蛋白樣品適合SDS-PAGE電泳或Western Blot檢測(cè)。加入50 μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液，95oC加熱5分鐘。4 ℃ 12000 g離心 5 min，收集上清至新的離心管中。
(2)  非變性洗脫法：洗脫后的蛋白保持原有的生物活性，便于后續(xù)檢測(cè)（例如SDS-PAGE、Western-blot、質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)等）。每10 μL樹脂，加入10 μL洗脫緩沖液，渦旋震蕩20 s，放混勻儀上室溫洗脫10~15 min，渦旋震蕩20 s；4 ℃ 12000 g離心 5 min，收集上清至新的離心管中，- 80℃保存或直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)

1.  本產(chǎn)品僅限于科學(xué)研究使用，不得用于臨床診斷或治療。
2.  為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。