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            發(fā)表期刊：Oncogene

影響因子：7.971

合作單位：中山大學(xué)腫瘤中心

運(yùn)用技術(shù)：LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 研究背景

鼻咽癌（NPC）是一種起源于鼻咽腔粘膜的上皮惡性腫瘤，超過70％的NPC病例被診斷為晚期疾病，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是NPC死亡的兩個(gè)主要原因。越來越多的研究表明，長(zhǎng)的非編碼RNA（lncRNA）在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。然而，lncRNA在鼻咽癌（NPC）中的功能和調(diào)控機(jī)制仍然未知。

● 內(nèi)容概述

2020年7月，中山大學(xué)腫瘤防治中心在期刊MS-Oncogene（IF₂₀₂₀=9.867）上發(fā)表題為“AR-induced long non-coding RNA LINC01503 facilitates proliferation and metastasis via the SFPQ-FOSL1 axis in nasopharyngeal carcinoma”的文章，發(fā)現(xiàn)LINC01503在NPC中高表達(dá)并與不良預(yù)后有關(guān)，在體外促進(jìn)NPC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。LINC01503募集了富含脯氨酸和谷氨酰的剪接因子胺（SFPQ）來激活Fos like 1（FOSL1）轉(zhuǎn)錄，而FOSL1的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LINC01503敲低對(duì)NPC進(jìn)展的抑制作用。此外，雄激素受體（AR）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活是NPC細(xì)胞中LINC01503過表達(dá)以及AR配體依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的原因。這些發(fā)現(xiàn)表明，AR誘導(dǎo)的LINC01503可以通過SFPQ-FOSL1通路促進(jìn)NPC發(fā)展，或成為新的NPC預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

● 主要技術(shù)

RNA pull-down、RIP、RNA-Seq、ChIP、熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、過表達(dá)/敲除實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)腫瘤異種移植模型構(gòu)建。輝駿生物為本研究提供了蛋白檢測(cè)和分析服務(wù)。

● 研究路線

● 研究結(jié)果

1. LINC01503在鼻咽癌中高表達(dá)，與預(yù)后不良相關(guān)

在先前的全基因組lncRNA圖譜中發(fā)現(xiàn)，LINC01503在鼻咽癌組織中高表達(dá)(圖1A)。為了證實(shí)這一結(jié)果，研究者用定量RT-PCR方法檢測(cè)了20例鼻咽癌組織和16例正常鼻咽組織中LINC01503的表達(dá)水平。結(jié)果表明，LINC01503在鼻咽癌組織中明顯過表達(dá)(圖1B)；此外，與正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69和N2Tert相比，LINC01503在11個(gè)鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)顯著上調(diào)(圖1C)。后續(xù)臨床分析結(jié)果表明，LINC01503水平高的患者總體、無病和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生存率比LINC01503水平低的患者差(圖1D-F)。研究者結(jié)合LINC01503的表達(dá)和TNM分期數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一個(gè)預(yù)測(cè)鼻咽癌(214例)預(yù)后的模型，將鼻咽癌患者分為三組，Kaplan-Meier曲線顯示這三組鼻咽癌患者的生存前景不同(圖1G-I)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明LINC01503在鼻咽癌中高表達(dá)，可作為判斷鼻咽癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。

  圖1

2. LINC01503促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)、遷移和侵襲                         

為了確定LINC01503在鼻咽癌中的潛在作用，研究者在HK1細(xì)胞中特異性地下調(diào)了內(nèi)源性LINC01503的表達(dá)，然后進(jìn)行RNA-seq以確定LINC01503被敲除后所影響的下游基因。針對(duì)這些基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，LINC01503與鼻咽癌的進(jìn)展密切相關(guān)（圖2A）。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，研究者使用兩種不同的shLINC01503質(zhì)粒瞬時(shí)下調(diào)了LINC01503在HK1和SUNE1細(xì)胞中的表達(dá)，并進(jìn)行了體外功能分析(圖2B)。結(jié)果進(jìn)一步表明，LINC01503基因的敲除顯著抑制了鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖遷移與侵襲能力(圖2C-F)。

圖2

3. LINC01503與SFPQ直接結(jié)合

已有報(bào)道表明，LncRNA通過與特定蛋白相互作用而發(fā)揮功能。研究者使用生物素標(biāo)記的LINC01503正義或反義序列進(jìn)行RNApull down實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定與LINC01503相互作用的蛋白(圖3B)。結(jié)果表明，剪接因子SFPQ是高度富集的蛋白之一(圖3C)。為進(jìn)一步驗(yàn)證LINC01503與SFPQ之間的相互作用，研究者用抗SFPQ抗體進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LINC01503 RNA明顯富集(圖3D)，敲除LINC01503后LINC01503與SFPQ之間的相互作用消失(圖3E)。接下來，為確定LINC01503與SFPQ結(jié)合所需的特異性片段，研究者構(gòu)建了一系列LINC01503截短質(zhì)粒并進(jìn)行了RNA pull down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LINC01503的敲除或過表達(dá)既不影響SFPQ mRNA水平，也不影響SFPQ蛋白水平(圖3H，I)。這些結(jié)果表明，LINC01503可以直接與SFPQ結(jié)合。

圖3

4. LINC01503招募SFPQ激活FOSL1轉(zhuǎn)錄

作為一種多功能核蛋白，SFPQ可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子或激活因子來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。為了確定LINC01503/SFPQ在鼻咽癌中的靶基因，研究者分析了LINC01503基因敲除前后HK1細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)。在前20個(gè)上調(diào)和下調(diào)的基因中，F(xiàn)OSL1在鼻咽癌組織中過表達(dá)，且與LINC01503的表達(dá)呈正相關(guān)(圖4B，C)。LINC01503或SFPQ的敲除都能降低FOSL1mRNA和蛋白水平(圖4D，E)。接下來，Transfac和Weblogo程序預(yù)測(cè)到在FOSL1基因的啟動(dòng)子區(qū)域有兩個(gè)SFPQ結(jié)合位點(diǎn)(圖4F，G)。ChIP-PCR結(jié)果表明，LINC01503基因敲除后，F(xiàn)OSL1啟動(dòng)子區(qū)域的SFPQ富集現(xiàn)象可被顯著消除(圖4H)。此外，熒光素酶報(bào)告分析表明，過表達(dá)SFPQ顯著提高了FOSL1野生型啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的熒光素酶活性，但不能增加突變報(bào)告結(jié)構(gòu)的熒光素酶活性(圖4I)。最后，DNase I酶切分析表明，LINC01503或SFPQ基因敲除顯著抑制了FOSL1啟動(dòng)子位點(diǎn)的染色質(zhì)可及性(圖4J)。這些結(jié)果表明，LINC01503可以招募SFPQ激活FOSL1轉(zhuǎn)錄活性并增加其表達(dá)。

圖4

5. FOSL1負(fù)責(zé)LINC01503/SFPQ介導(dǎo)的鼻咽癌進(jìn)展

為了確定LINC01503/SFPQ是否通過激活FOSL1促進(jìn)鼻咽癌的進(jìn)展，研究者在HK1和SUNE1細(xì)胞中引入FOSL1過表達(dá)或空載體，穩(wěn)定下調(diào)LINC01503(Sh1503)或其對(duì)照(ShCtrl)，CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)FOSL1可以解除LINC01503基因敲除對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制作用(圖5A-C)。Transwell分析表明，LINC01503的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LINC010503基因敲除對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用(圖5D)。這些結(jié)果表明，LINC01503通過激活FOSL1促進(jìn)鼻咽癌的進(jìn)展。

圖5

6. LINC01503敲除對(duì)鼻咽癌腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用

為確定LINC01503在鼻咽癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用，研究者建立了腫瘤生長(zhǎng)模型。結(jié)果表明，LINC01503基因的敲除顯著延緩了腫瘤的生長(zhǎng)，并在大小上明顯小于對(duì)照組（圖6A-C）。接下來，研究者建立了腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型(圖6D)，結(jié)果顯示LINC01503基因敲除組腹股溝淋巴結(jié)較小，重量較輕(圖6E，F(xiàn))；腫瘤侵襲性較弱，對(duì)皮膚和肌肉的侵襲能力減弱(圖6G)；腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯低于對(duì)照組(圖6H，I)。還建立了肺轉(zhuǎn)移定植模型，結(jié)果表明LINC01503基因敲除組肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較對(duì)照組少(圖6J，K)，轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較對(duì)照組明顯減少和縮小(圖6L)。這些數(shù)據(jù)均表明，LINC01503在體內(nèi)促進(jìn)了鼻咽癌腫瘤的生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。

圖6

7. AR激活LINC01503轉(zhuǎn)錄以增加其在鼻咽癌中的表達(dá)

使用Jaspar軟件對(duì)LINC01503的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)了兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子：ALX Homeobox 3(ALX3)和AR(圖7A)。研究者發(fā)現(xiàn)AR的敲除明顯降低了LINC01503在HK1和SUNE1細(xì)胞中的表達(dá)，ALX3的敲除則沒有(圖7B)。此外，AR的過表達(dá)增加了LINC01503的RNA表達(dá)(圖7C)。更重要的是，AR在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)，并與LINC01503的表達(dá)呈正相關(guān)(圖7D，E)。研究者用Jaspar軟件預(yù)測(cè)了LINC01503啟動(dòng)子區(qū)域的兩個(gè)高親和力結(jié)合位點(diǎn)(圖7F)，CHIP-PCR顯示AR的異位表達(dá)顯著增強(qiáng)了其在LINC01503啟動(dòng)子區(qū)域的富集(圖7G)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AR的敲除顯著降低了野生型LINC01503啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的熒光素酶活性，但沒有降低突變報(bào)告結(jié)構(gòu)的熒光素酶活性(圖7H)。最后，通過DNase I酶切實(shí)驗(yàn)，研究者觀察到AR基因敲除顯著抑制了LINC01503啟動(dòng)子位點(diǎn)的染色質(zhì)可及性(圖7I)。這些結(jié)果說明AR激活了鼻咽癌LINC01503的轉(zhuǎn)錄。

圖7

8. AR拮抗劑ENZ可能通過阻斷LINC01503的上游轉(zhuǎn)錄來抑制鼻咽癌的惡性進(jìn)展

為了進(jìn)一步闡明LINC01503的AR配體依賴性激活，研究者進(jìn)行了AR反應(yīng)和抑制試驗(yàn)。結(jié)果表明，在AR激動(dòng)劑雙氫睪酮(DHT)處理過程中，LINC01503呈時(shí)間依賴和劑量依賴的激活；在拮抗劑苯扎魯胺(ENZ)存在下，LINC01503呈時(shí)間依賴和劑量依賴的抑制(圖8A，B)。有趣的是，DHT處理導(dǎo)致細(xì)胞功能的激活，而AR處理則導(dǎo)致細(xì)胞功能的抑制(圖8C-E)，接下來，研究者研究了LINC01503的表達(dá)對(duì)ENZ抑制的鼻咽癌細(xì)胞惡性表型的影響，發(fā)現(xiàn)ENZ抑制的細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲可以通過增加LINC01503在細(xì)胞中的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)(圖8F-H)。這些結(jié)果證實(shí)了AR拮抗劑ENZ可能通過阻斷LINC01503的上游轉(zhuǎn)錄來抑制鼻咽癌的惡性進(jìn)展。

圖8

● 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)LINC01503在鼻咽癌中高表達(dá)，與不良預(yù)后和較低的生存率有關(guān)。AR激活了鼻咽癌中LINC01503的轉(zhuǎn)錄，使LINC01503募集SFPQ到FOSL1啟動(dòng)子，增加FOSL1轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)展。抑制LINC01503的表達(dá)和開發(fā)AR配體拮抗劑可能成為NPC的一種靶向治療策略。