如何區(qū)別幾種不同蛋白互作實(shí)驗(yàn)方法(IP/Co-IP/GST pull down)？

理論知識點(diǎn)看了多遍，但還是分不清IP，Co-IP，GST pull down？輝駿生物在下文除了介紹介紹IP與Co-IP區(qū)別知識要點(diǎn)，也將研究蛋白互作幾種方法（酵母雙雜交系統(tǒng)（Y2H），CO-IP的關(guān)系，GST-Pull Down）之間的區(qū)別以及優(yōu)缺點(diǎn)簡明扼要的收納進(jìn)來。

獨(dú)角戲——IP:

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）就是用偶聯(lián)相應(yīng)抗體的磁珠把你要研究的蛋白X免疫沉淀下來，然后去檢測它。例如蛋白X在細(xì)胞內(nèi)的蛋白量不同，或者有著不同的翻譯后修飾，這時(shí)就可以用X蛋白抗體+Prorein A beads來進(jìn)行IP，從細(xì)胞中把蛋白X拉下，再用特異的抗體（如磷酸化，泛素化抗體）進(jìn)行WB來檢測蛋白X的變化。簡言之，IP就是檢測單個(gè)蛋白的狀態(tài)（高矮胖瘦，有沒有戴帽子，穿的什么衣服等等）。

免疫沉淀

眾里尋她千百度——酵母雙雜交系統(tǒng)（Y2H）：

酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程的認(rèn)識。真核生物中基因轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DNA-BD）和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Activation domain，AD），這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以獨(dú)立分開，功能互不影響。BD和AD分別單獨(dú)作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，只有當(dāng)二者在空間上充分接近時(shí)，才呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子活性，使下游基因得到轉(zhuǎn)錄。根據(jù)這一原理，可設(shè)計(jì)酵母雙雜交系統(tǒng)。

將兩待研究蛋白（蛋白 X 與蛋白 Y）分別與 BD、AD 結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合質(zhì)粒。將構(gòu)建好的兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩蛋白之間不存在相互作用，則下游基因（報(bào)告基因）不會轉(zhuǎn)錄表達(dá)；如果兩個(gè)蛋白間存在相互作用，則BD與AD兩結(jié)構(gòu)域空間上很接近，從而下游基因（報(bào)告基因）得以轉(zhuǎn)錄。通過報(bào)告基因表達(dá)與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。

通常在現(xiàn)實(shí)情況中，與蛋白X存在潛在互作可能的候選蛋白會有好幾種（Y，Z，A，B等），這時(shí)我們就可以通過酵母雙雜交在體內(nèi)篩選與X有相互作用的蛋白Y。

酵母雙雜交系統(tǒng)

遇見愛情——Co-IP：

竟然我們在體內(nèi)驗(yàn)證過，那么蛋白X和蛋白Y在體外是否也存在相互作用了？這個(gè)時(shí)候我們可以用到CoIP了~

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）的原理和IP是一樣的，當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用被保留了下來，假如細(xì)胞內(nèi)存在 XY 蛋白復(fù)合物，用 X（X也稱為誘餌蛋白）的抗體免疫沉淀 X，那么與

X 在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y（Y也稱為靶蛋白）也被沉淀下來。因此在細(xì)胞裂解液中加入 X 的抗體沉淀蛋白X，隨后利用蛋白印跡（western blot，WB）檢測沉淀中是否存在蛋白 Y，如果存在，則說明細(xì)胞內(nèi)存在XY蛋白復(fù)合物，即蛋白XY存在相互作用。（在體外驗(yàn)證X和Y之間有聯(lián)系）

免疫共沉淀

免疫共沉淀（Co-IP）

在我們用酵母雙雜交和Ｃo-IP雙保險(xiǎn)驗(yàn)證X和Y之間確實(shí)存在相互作用后，我們發(fā)現(xiàn)酵母雙雜交和Ｃo-IP的結(jié)果都只能說明X和Y之間有相互作用，但并不能確定這種相互作用是直接的還是間接的，這個(gè)時(shí)候存在兩種可能：

X與Y之間存在直接的相互作用（X和Y自由戀愛一見鐘情）
也就是說也許是X與M相互作用，而Y也和M相互作用，這樣，用A的抗體可以把M拉下來，但同時(shí)M又把B也拉下來了（X和Y是通過他們共同的朋友M介紹才認(rèn)識然后在一起的）

要想準(zhǔn)確確定X和Y直接的作用到底是直接的還是間接的了，這個(gè)時(shí)候我們需要祭出我們大boss——GST pull down實(shí)驗(yàn)~

GST pull down：

GST pull-down實(shí)驗(yàn)是一個(gè)行之有效的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù), 近年來越來越受到廣大學(xué)者的青睞。

原理：將靶蛋白和GST組成的融合蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）親和樹脂上，作為與目的蛋白親和支撐物,充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得，此方法簡單易行，操作方便。

GST-Pull Down

如何選擇：

Co-IP，GST pull down和酵母雙雜交是研究蛋白互做最常用的三種方法，一般常用酵母雙雜交來篩選，用Co-IP和GST pull down用來驗(yàn)證。研究不僅在整體蛋白層面，還包括蛋白的結(jié)構(gòu)域?qū)用?，GST pulldown是用來驗(yàn)證蛋白X與Y是直接結(jié)合的，而Y2H和Co-IP結(jié)果則還有間接作用以及非特異性作用。

輝駿生物專業(yè)提供Co-IP免疫共沉淀、GST pull down、RNA pull down、DNA pull down等多種蛋白互作實(shí)驗(yàn)，近十年服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，客戶成果發(fā)表在Nature Methods，Oncogene，Cell Research等高水平期刊上。自有蛋白質(zhì)組學(xué)平臺，對質(zhì)譜鑒定有十足的把控能力，對后續(xù)的生物信息分析有獨(dú)到的見解；售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章，確?？蛻舭残倪M(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)及投稿。