基因組編輯：概述

基因包含編碼生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)所需的信息。  編輯基因是研究活生物體代謝和生理過程的遺傳基礎(chǔ)的基石。  多年來，科學(xué)家為此目的使用了許多技術(shù)，特別是用于研究具有工業(yè)或科學(xué)價(jià)值的細(xì)菌，例如自殺質(zhì)粒。

其他原核生物基因組編輯方法包括 lambda Red 系統(tǒng)和 ClosTron 方法。  傳統(tǒng)的微生物基因組編輯技術(shù)已被證明是緩慢而費(fèi)力的。

傳統(tǒng)基因組編輯方法的缺點(diǎn)之一是必須將抗性標(biāo)記盒引入微生物基因組，這不適合更精確的編輯，例如單氨基酸突變。  需要幾個(gè)步驟，包括同源重組和切除不必要的 DNA 區(qū)域。  基因組操作會(huì)留下干擾下游基因工程的殘余物。  這些缺點(diǎn)促進(jìn)了對(duì)更好方法的需求。

CRISPR-Cas

CRISPR-Cas 是一項(xiàng)極大地改變了基因組編輯方式的技術(shù)。  這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)存在了不到二十年，但已經(jīng)在生物化學(xué)、微生物學(xué)、藥物開發(fā)和食品工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。  該技術(shù)為為特定目的定制微生物開辟了強(qiáng)大的可能性。

CRISPR 是一種比傳統(tǒng) DNA 編輯方法更快、更便宜、更準(zhǔn)確的技術(shù)。  它使科學(xué)家能夠通過刪除、添加或更改特定的 DNA 部分來編輯基因組的特定部分。

該系統(tǒng)使用兩個(gè)關(guān)鍵分子將突變引入 DNA。  這些是一種稱為 Cas9 的酶，它在特定位置切割雙鏈 DNA 以插入新的遺傳鏈，并引導(dǎo) RNA (gRNA)。gRNA 是預(yù)先設(shè)計(jì)的 RNA 序列，通常包含大約 20 個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度在較大的 RNA“支架”內(nèi)，它將 Cas9 蛋白引導(dǎo)至目標(biāo) DNA 序列進(jìn)行編輯。  gRNA 具有與目標(biāo) DNA 序列互補(bǔ)的堿基。

Cas9 酶切割兩條 DNA 鏈并將 RNA 序列插入遺傳密碼的目標(biāo)區(qū)域。  細(xì)胞識(shí)別出DNA受損并用新的DNA序列修復(fù)它。  因此，細(xì)胞的遺傳密碼被 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)改變，并且可以制造新一代細(xì)胞，表達(dá)編輯的遺傳密碼并為多種目的制造新蛋白質(zhì)。

Cas基因的功能

Cas（CRISPR相關(guān)）基因常見于細(xì)菌和古細(xì)菌中。  它們充當(dāng)識(shí)別外源 DNA 的一種方式，本質(zhì)上，CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一種原始免疫機(jī)制。  迄今為止，已鑒定出多個(gè) Cas 基因，其中 Cas9 是 CRISPR-Cas 技術(shù)中使用最多的基因。

微生物基因組編輯：CRISPR-Cas9 及其他

雖然 CRISPR-Cas9 由于其簡(jiǎn)單性和成本優(yōu)勢(shì)已被廣泛用于編輯真核細(xì)胞，但該系統(tǒng)不太適合細(xì)菌基因組編輯。  這是由于該技術(shù)仍然存在的挑戰(zhàn)。  已經(jīng)開發(fā)了多種基于 CRISPR-Cas9 的方法來克服因使用的質(zhì)粒數(shù)量和特定誘導(dǎo) DNA 修復(fù)機(jī)制等因素而變化的挑戰(zhàn)。

用于微生物基因組編輯的 CRISPR-Cas9 方法的主要缺點(diǎn)之一是細(xì)胞毒性。 這是由于工程微生物中 Cas9 的過度表達(dá)（這是 大腸桿菌 ，但也發(fā)生在其他細(xì)菌物種中）并導(dǎo)致缺乏菌落。 即使沒有核酸酶活性也會(huì)發(fā)生這種情況。 此外，Cas9 錯(cuò)配可導(dǎo)致微生物基因組內(nèi)脫靶位置的雙鏈斷裂。

已經(jīng)開發(fā)了 CRISPR-Cas 介導(dǎo)的微生物基因組編輯的替代策略，以克服該系統(tǒng)的這些缺點(diǎn)。  其中包括無痕 Cas9 輔助重組、誘導(dǎo)重組酶、在質(zhì)粒中編碼 DNA 修復(fù)模板、使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、CRISPR 樣 DNA 切口酶的核酸酶、內(nèi)源性 CRISPR 系統(tǒng)，以及使用腺嘌呤脫氨酶等堿基編輯器。

最近探索的另一種替代方法是使用預(yù)制的核糖核蛋白 (RNP) 復(fù)合物來傳遞 CRISPR-Cas 機(jī)器，而不是使用質(zhì)粒。 這種方法用途廣泛。 這種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它不依賴于微生物翻譯和轉(zhuǎn)錄機(jī)制，并功效通過核酸酶測(cè)定預(yù)先 RNP 復(fù)合物在使用后降解，避免了 Cas9 的過度表達(dá)。

微生物基因組編輯是一種為醫(yī)藥、食品和工業(yè)化學(xué)品生產(chǎn)等行業(yè)量身定制多種重要產(chǎn)品的強(qiáng)大方法。  許多傳統(tǒng)的基因組編輯方法費(fèi)力、昂貴、耗時(shí)，并且具有一定程度的不準(zhǔn)確性。CRISPR-Cas 已成為編輯真核和原核細(xì)胞基因組的核心技術(shù)，但仍存在阻礙其廣泛應(yīng)用于微生物基因組編輯的挑戰(zhàn)。  這些挑戰(zhàn)目前正在通過研究替代策略來解決，盡管它仍然是一項(xiàng)新技術(shù)，使用這些方法來工程微生物的未來是有希望的。