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中文標(biāo)題：CircVPRBP通過(guò)抑制RACK1蛋白O-GlcNAc修飾和穩(wěn)定性來(lái)阻礙宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

發(fā)表期刊：Oncogene

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：8.756

發(fā)表時(shí)間：2023年1月

合作單位：中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院

運(yùn)用技術(shù)：RNA免疫共沉淀（RIP）、LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌（CCa）患者最?lèi)盒缘呐R床特征之一，但目前尚不清楚如何有效防止淋巴管生成和抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲性。circRNA比線(xiàn)性mRNA更穩(wěn)定，可能參與許多癌癥的進(jìn)展。先前的研究發(fā)現(xiàn)，circVPRBP (hsa_circ_0065898)是在CCa中水平下調(diào)。因此本研究探索了circVPRBP在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)功能和臨床意義。

● 研究結(jié)果

1. CircVPRBP在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中表達(dá)下調(diào)

Sanger測(cè)序首先確定了circVPRBP的剪接位點(diǎn)（圖1A）。RT-qPCR再次確認(rèn)了circVPRB在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)，并且在原發(fā)性腫瘤衍生細(xì)胞系HeLa、HeLa229、SiHa、C33A中的含量比轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)衍生細(xì)胞系HT-3和MS751的更高（圖1B）。同樣的，circVPRBP在宮頸癌患者樣本中的水平顯著低于非腫瘤組織，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本中的表達(dá)逐漸消失（圖1C）。原位雜交、LYVE-1染色、Kaplan–Meier生存曲線(xiàn)和log-rank檢驗(yàn)分析等實(shí)驗(yàn)表明， circVPRBP表達(dá)缺失在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性腫瘤中更常見(jiàn)（圖1D），當(dāng)circVPRBP水平較低時(shí)，宮頸癌瘤內(nèi)和瘤周區(qū)域的淋巴管數(shù)量顯著增加（圖1E、F），且患者的總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS）較短（圖1G，H）。表明circVPRBP的缺失有助于宮頸癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，它的水平對(duì)宮頸癌患者有預(yù)后價(jià)值。

  圖1

2. CircVPRBP可抑制宮頸癌的體外細(xì)胞侵襲和體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移                                                       

研究者構(gòu)建了circVPRBP過(guò)表達(dá)和沉默的宮頸癌細(xì)胞系（圖2A-D），并進(jìn)行了體外和體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)。Transwell結(jié)果表明，circVPRBP過(guò)表達(dá)消除了宮頸癌細(xì)胞的侵襲性，沉默促進(jìn)了侵襲能力（圖2E，F(xiàn)）。在裸鼠體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型中（圖2G），circVPRBP過(guò)表達(dá)顯著抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)體積較小，沉默可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)體積較大（圖2H,I）。角蛋白免疫組化染色也表明，circVPRBP過(guò)表達(dá)顯著抑制了宮頸癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移能力，沉默增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖2J，K）。這些結(jié)果表明circVPRBP可以抑制體內(nèi)宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

圖2

3. CircVPRBP抑制體內(nèi)和體外的淋巴管生成

淋巴管生成在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中具有重要作用，因此靶向淋巴管生成的信號(hào)通路可能是一種有效的治療策略。為了驗(yàn)證circVPRB是否影響淋巴管生成，使用淋巴標(biāo)記物L(fēng)YVE-1的抗體進(jìn)行免疫組化（IHC）分析，發(fā)現(xiàn)在circVPRBP過(guò)表達(dá)的小鼠體內(nèi)，LYVE-1陽(yáng)性血管顯著減少，而在circVPRB沉默的小鼠體內(nèi)顯著升高（圖3A，B），表明circVPRBP在體內(nèi)抑制淋巴管生成。血管形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，circVPRBP過(guò)表達(dá)顯著抑制了人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（HLEC）的血管形成，而circVPRB缺失顯著增加了HLEC的血管形成能力（圖3C，D）。

圖3

致瘤性是與淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的主要因素，因此研究人員分析了circVPRBP在宮頸癌中的致瘤作用。CCK-8、克隆形成和EdU增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circVPRBP過(guò)表達(dá)降低了宮頸癌細(xì)胞的增殖和克隆形成，而circVPRBP沉默有相反作用（圖4A-H）。之后，通過(guò)構(gòu)建皮下異種移植動(dòng)物模型以評(píng)估circVPRBP在體內(nèi)的致瘤能力，發(fā)現(xiàn)circVPRBP過(guò)表達(dá)降低了宮頸癌的腫瘤生長(zhǎng)（圖4I），且腫瘤重量和大小均低于對(duì)照組（圖4J-O）。這些結(jié)果表明circVPRBP可以抑制癌癥淋巴管的生成。

圖4

4. CircVPRBP與RACK1相互作用抑制RACK1蛋白表達(dá)

接著，研究者以circVPRBP作為誘餌進(jìn)行了RNA pull down和質(zhì)譜（MS）檢測(cè)，找到了circVPRBP的潛在結(jié)合蛋白R(shí)ACK1（圖5A，B），RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)確定了兩者的內(nèi)源性結(jié)合（圖5C，D），熒光共定位實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)circVPRBP和RACK1蛋白共定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖5E）。circVPRBP截短片段的RNA pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了其122-182nt片段與RACK1蛋白結(jié)合（圖5F、G）。過(guò)表達(dá)circVPRBP幾乎不影響RACK1的mRNA表達(dá)，但顯著降低了RACK1的蛋白水平(圖5F, G)。已有研究表明，宮頸癌細(xì)胞中的RACK1通過(guò)增強(qiáng)Galectin-1誘導(dǎo)的下游FAK和AKT信號(hào)通路，促進(jìn)宮頸癌癥淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)circVPRBP也抑制了pAKT、pFAK和Galectin-1的表達(dá)（圖5I–K）?？傊@些結(jié)果表明circVPRBP可以結(jié)合RACK1并抑制RACK1蛋白的表達(dá)。

圖5

5. CircVPRBP可阻礙RACK1-S122位點(diǎn)的O-GlcNAc修飾來(lái)使其降解

為了探討circVPRBP是否通過(guò)蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解誘導(dǎo)RACK1蛋白下調(diào)，研究者首先使用蛋白酶體抑制劑MG132處理宮頸癌細(xì)胞，當(dāng)?shù)鞍?/span>降解被MG132處理阻斷時(shí)，過(guò)表達(dá)或干擾circVPRBP不改變RACK1蛋白水平（圖6A，B）。用CHX蛋白合成抑制劑處理后，過(guò)表達(dá)circVPRBP加速了RACK1蛋白的降解，沉默有相反效果（圖6C），此外，circVPRBP過(guò)表達(dá)導(dǎo)致RACK1蛋白的多泛素化顯著增加（圖6D）。先前的文獻(xiàn)表明，O-GlcNAc糖基化修飾影響RACK1的穩(wěn)定性，那么circVPRBP是否影響RACK1的O-GlcNAc修飾呢？免疫共沉淀（Co-IP）發(fā)現(xiàn)circVPRBP過(guò)表達(dá)顯著降低了RACK1的O-GlcNAc（RL2）水平，并降低了O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(OGT)與RACK1之間的結(jié)合（圖6E），沉默circVPRBP有相反結(jié)果（圖6F）。RACK1的S122-O-GlcNAc位點(diǎn)突變使circVPRBP不再促進(jìn)RACK1降解（圖6G）。RNA pull down分析發(fā)現(xiàn)，缺失WD3區(qū)的RACK1突變體（ΔWD3-RACK1-flag）不能與circVPRBP結(jié)合，表明WD3區(qū)域包含circVPRBC結(jié)合位點(diǎn)。CoIP實(shí)驗(yàn)也表明，ΔWD3-RACK1不能與OGT結(jié)合，說(shuō)明WD3區(qū)域也包含OGT結(jié)合位點(diǎn)（圖6H）。這些結(jié)果表明circVPRBP通過(guò)阻斷RACK1的S122位點(diǎn)O-GlcNAc糖基化介導(dǎo)RACK1降解。

圖6

6. CircVPRBP以RACK1-依賴(lài)的方式抑制宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

接下來(lái)，通過(guò)挽救試驗(yàn)分析了circVPRBP是否以RACK1依賴(lài)的方式抑制細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。在宮頸癌細(xì)胞中使用Tet-on誘導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)RACK1表達(dá)，同時(shí)過(guò)表達(dá)circVPRBP或空載體（圖7A），也構(gòu)建了相應(yīng)的異種移植小鼠腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果顯示Dox誘導(dǎo)的RACK1逆轉(zhuǎn)了circVPRBP對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的抑制作用（圖7B），circVPRBP過(guò)表達(dá)組的腘窩淋巴結(jié)體積明顯小于對(duì)照組，并且Dox誘導(dǎo)的RACK1組的淋巴結(jié)體積大于空載體和circVPRBP過(guò)表達(dá)組（圖7C）。角蛋白免疫染色實(shí)驗(yàn)表明，circVPRBP過(guò)表達(dá)顯著抑制了宮頸癌細(xì)胞向腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的能力，Dox誘導(dǎo)的RACK1逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)（圖7D、E）。此外，Dox誘導(dǎo)的RACK1在體內(nèi)和體外顯著逆轉(zhuǎn)了circVPRBP對(duì)淋巴管生成的抑制作用（圖7F–I）。這些結(jié)果說(shuō)明circVPRBP通過(guò)參與RACK1降解來(lái)抑制宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。

圖7

此外，研究者還構(gòu)建了體內(nèi)皮下異種移植模型來(lái)確定circVPRB對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制是否也通過(guò)RACK1起作用。結(jié)果顯示，Dox誘導(dǎo)的RACK1逆轉(zhuǎn)了circVPRB過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制（圖8A-C）。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)Dox誘導(dǎo)的RACK1消除了circVPRBP對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的抑制（圖8D-I），逆轉(zhuǎn)了circVPRBP對(duì)Galectin-1、pAKT和pFAK表達(dá)水平的抑制（圖8J）。在宮頸癌患者中，低circVPRBP表達(dá)和高RACK1表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性（圖8K）。這些研究結(jié)果表明，circVPRBP通過(guò)促進(jìn)RACK1的降解來(lái)抑制宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

圖8

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