特级毛片在线大全免费播放_久久精品www人人爽人人_亚洲欧美日韩国产综合久_国产在线精品一区二区网站免费_成人性生生活性生交

中文標(biāo)題：捕獲新轉(zhuǎn)錄RNA的相互作用體，或促進對不同細(xì)胞和系統(tǒng)中總RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組的深入研究

發(fā)表期刊：Nature Methods

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：47.990

發(fā)表時間：2018年2月

合作單位：中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)學(xué)與健康研究所

合作技術(shù)：輝駿生物為作者單位之一，為該項目提供部分技術(shù)服務(wù)

● 研究背景

目前系統(tǒng)研究RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組的方法主要是基于捕獲多聚腺苷酸(PolyA)RNA，主要是帶有寡聚(DT)包被珠的mRNA。然而PolyA尾巴只在新轉(zhuǎn)錄的RNA成熟的過程中被添加到RNA中，而一些成熟的mRNA要么是非PolyA的，要么是雙態(tài)的。此外，成熟的非PolyA RNA物種占所有轉(zhuǎn)錄序列的很大一部分。捕獲與所有類型RNA相互作用的RNA結(jié)合蛋白的方法不僅可以擴大我們目前對RNA相互作用組的看法，而且有助于理解非Polya RNA在生理和疾病中的功能。

● 研究結(jié)果

1. 利用RICK技術(shù)捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA互作組

研究者用Eu標(biāo)記HeLa細(xì)胞中的RNA，固定細(xì)胞后通過RICK反應(yīng)使Eu生物素化，然后用鏈霉親和素磁珠珠提取RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。凝膠電泳和銀染證實RICK方法成功分離出與EU標(biāo)記RNA直接相互作用的蛋白質(zhì)；Western blotting驗證了RICK法對已知RNA相關(guān)蛋白的捕獲。

  圖1

2. Rick捕獲的RNA種類                                                                              

研究者對RICK RNA pull down技術(shù)捕獲的樣本進行了轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)，分析結(jié)果(圖2A)與Castello的oligo(DT)捕獲數(shù)據(jù)相比顯示出明顯的差異，在該數(shù)據(jù)中，捕獲的RNA中80%是mRNA。接下來，研究者研究了RICK樣本中的富集與三種相關(guān)的非PolyA RNA：circRNA、近端啟動子RNA(ppRNA)和增強子RNA(ERNA)的oligo(Dt)捕獲情況。在對ppRNA的評估中，與oligo(Dt)捕獲相比，Rick樣本中轉(zhuǎn)錄暫?；?TR>4)在TSS周圍積累了更高的RNA-seq信號，這表明僅通過Rick就能有效地分離ppRNA；而非暫停基因(TR<4)差異則很小(圖2B，C)。此外，在RICK樣本中，RNA-seq信號在假定的增強子區(qū)域16(6.05%)上有很強的富集，而在寡核苷酸(DT)捕獲中幾乎沒有(0.11%)(圖2D)。RT-qPCR進一步證實，與oligo(Dt)捕獲相比，用RICK提取的非Polya RNA分離效果良好。簡言之，除Polya RNA外，RICK還成功地分離出了其他各種RNA種類，表明它也可以富集不是通過寡核苷酸(DT)捕獲方法分離的相關(guān)結(jié)合蛋白。

圖2

3. RICK法分離蛋白質(zhì)的特性研究

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對RICK分離的蛋白質(zhì)進行分析。與oligo(DT)捕獲在不同條件下的比較表明，RICK分離了許多在oligo(DT)捕獲研究中沒有鑒定到的蛋白質(zhì)）（圖3B），這些差異既不是由于細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白質(zhì)組學(xué)程序的差異，也不是由Eu標(biāo)記引起的（圖3A）。

圖3

4. RICK分離蛋白的功能分析

對295個RICK特有的RBP進行了GO分析，觀察了與有絲分裂相關(guān)的生物過程的富集(圖4A)。KEGG途徑分析還將“細(xì)胞周期”列為前十個最顯著富集的途徑（圖4B）。相反，對Rick鑒定的425種蛋白質(zhì)進行的GO和KEGG分析顯示，oligo（dT）捕獲數(shù)據(jù)集中存在的蛋白質(zhì)主要與RNA相關(guān)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進一步加強了RICK在分離用寡核苷酸(DT)捕獲方法未鑒定出的蛋白質(zhì)方面的獨特性，并揭示了RNA在意想不到的細(xì)胞過程中的功能。

圖4

5. RICK識別與非polyA RNA優(yōu)先結(jié)合的蛋白質(zhì)

考慮到通過RICK 和oligo(DT)捕獲分離的RNA種類的顯著差異，295個RICK特有的RBP中有相當(dāng)一部分可能優(yōu)先與非polyA RNA結(jié)合。這種特異性可能是由于化學(xué)計量學(xué)、亞細(xì)胞定位或潛在的內(nèi)在結(jié)合特異性。LC-MS/MS鑒定出914個高置信度蛋白質(zhì)，稱之為“PolyA缺失型RICK蛋白”。在這914個蛋白質(zhì)中，576個與標(biāo)準(zhǔn)RICK程序的720個高置信度蛋白質(zhì)重疊(圖5A)。進一步分析表明，295個RICK特有的RBP中有204個(69.2%)與914個PolyA缺失型Rick蛋白重疊(圖5B)。此外，在710個與RICK特有RBP不重疊的710個polyA缺失型RICK蛋白中，有563個出現(xiàn)在oligo(DT)捕獲數(shù)據(jù)集中(圖5B)，這表明這些蛋白具有結(jié)合PolyA和非PolyA RNA的混合趨勢。這些結(jié)果表明，RICK可用于鑒定優(yōu)先與非Polya RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。

圖5

6. 與METTL1和CDK1相互作用的RNA特性

我們選擇了兩個RICK特有的RBP METTL1和CDK1，用PAR-CLIP測序方法研究了它們相互作用的RNA。METTL1的兩個獨立PAR-CLIP測序?qū)嶒烇@示捕獲的RNA存在廣泛重疊，其中很大一部分也被RICK捕獲。進一步分析證實METTL1與tRNA顯著結(jié)合，還與多種推測為非polyA的RNA結(jié)合，如內(nèi)含子RNA和從基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄的RNA（圖5C）。接下來，研究者使用隨機六聚體或寡聚體（dT）引物進行RNA免疫沉淀（RIP），然后進行RT-qPCR，以識別METTL1靶RNA是否具有polyA尾巴。RIP-qPCR顯示，使用隨機六聚體富集了7個mRNA，而使用寡聚(DT)引物只能擴增出其中的3個，證實了METTL1與含有mRNA序列的非PolyA RNA結(jié)合(圖5D)。CDK1 PAR-CLIP測序分析顯示與轉(zhuǎn)錄自基因間區(qū)域和內(nèi)含子RNA的RNA結(jié)合，與RICK捕獲的RNA也存在廣泛重疊。后續(xù)分析進一步表明，METTL1和CDK1廣泛地與非PolyA RNA結(jié)合，暗示這兩種蛋白的RNA相關(guān)功能被忽視。

7. 利用RICK捕獲新生RNA互作組

研究者對HeLa細(xì)胞進行了短Eu標(biāo)記(0.5、1和2小時)，以研究RICK是否可以捕獲與新生RNA互作的蛋白。鑒定了208種不同的高置信度蛋白質(zhì)(分別為149、119和143，作用時間分別為0.5、1和2小時)，稱之為“新生富集RBP”和319種低置信度蛋白質(zhì)(圖6A)。對208個新生富集RBP進行的GO和KEGG通路分析顯示，轉(zhuǎn)錄和RNA代謝相關(guān)術(shù)語顯著豐富(圖6B)。進一步的研究表明，新生RNA轉(zhuǎn)錄和局部代謝物產(chǎn)生之間存在聯(lián)系，從而調(diào)節(jié)表觀基因和潛在的表觀轉(zhuǎn)錄基因。

圖6

8. 利用RICK獲取mESC總RNA互作組

為證明RICK可以應(yīng)用于其他類型的細(xì)胞，研究者用鏈霉親和素結(jié)合辣根過氧化物酶證實了Eu在mESC中的有效摻入，并進行了LC-MS/MS，鑒定出518個高置信蛋白和304個低置信蛋白。這518個高置信度蛋白質(zhì)中有160個與Kwon等人報告的“mESC mRNA相互作用組”重疊，而358個是RICK獨有的，因此將其稱為RICK獨有的mESC RBP。對這358個候選限制性商業(yè)慣例的GO分析顯示，RNA結(jié)合或PolyA RNA結(jié)合術(shù)語豐富。在這358個蛋白中，有95個在mESC中的表達水平高于分化后的細(xì)胞，這表明mESC在自我更新或多能性方面具有潛在的作用。因此，RICK可以應(yīng)用于HeLa以外的不同細(xì)胞類型；此外還需要進一步的研究來確定新發(fā)現(xiàn)的候選RBP在mESC自我更新/多能性中的作用。

輝駿生物實驗外包服務(wù)商，10年專注科研實驗，專業(yè)提供全方位蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白/核酸互作、代謝組學(xué)、分子/細(xì)胞生物學(xué)、lncRNA專題實驗等科研服務(wù)。輝駿自有蛋白質(zhì)檢測平臺，對各類蛋白的質(zhì)譜鑒定有充足的把控能力，對后續(xù)的生物信息分析有獨到的見解。

目前，我們已為上千位客戶在Nature、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發(fā)表大量高分文章（點擊查看客戶文獻），歡迎各位咨詢lc-ms/ms檢測實驗，服務(wù)電話：4006991663！