特级毛片在线大全免费播放_久久精品www人人爽人人_亚洲欧美日韩国产综合久_国产在线精品一区二区网站免费_成人性生生活性生交

中文標(biāo)題：LINC00173通過刺激鼻咽癌中RAB1B介導(dǎo)的PA2G4和SDF4的分泌促進腫瘤進展

發(fā)表期刊：Molecular Oncology

中科院分區(qū)：2區(qū)

影響因子：7.449

發(fā)表時間：2023年1月

合作單位：中山大學(xué)腫瘤防治中心

運用技術(shù)：RNA pull down，LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

鼻咽癌（NPC）中超過70%的患者最初被診斷為局部晚期疾病，約20%的鼻咽癌患者在治療后出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)的情況。急需探索NPC進展的機制，以確定NPC患者的有效治療靶點。長非編碼RNA（lncRNA）沒有編碼蛋白質(zhì)功能，但可以作為其他生物分子的信號、誘餌、引物或支架，構(gòu)成一個巨大而精細(xì)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。之前的微陣列篩選顯示，LINC00173在NPC組織中顯著上調(diào)，本研究進一步確定了LINC00173的作用機制。

● 研究結(jié)果

1. LINC00173在鼻咽癌中上調(diào)并與預(yù)后不良相關(guān)

基于之前的微陣列數(shù)據(jù)(GSE126683)，研究者篩選發(fā)現(xiàn)了在鼻咽癌組織中顯著上調(diào)的LINC00173（圖1A），并通過qPCR實驗驗證了這一結(jié)果（圖1B）。此外，LINC00173在NPC細(xì)胞系中的表達也顯著高于正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69（圖1C）。Kaplan-Meier生存率分析顯示， LINC00173高表達的患者總生存期、無病生存期和遠端無轉(zhuǎn)移生存期較差（圖1D-F）。通過單變量和多變量Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)LINC00173的表達水平和TNM分期是顯著且獨立的預(yù)后決定因素，研究者將LINC00173的表達水平與TNM分期相結(jié)合，構(gòu)建了一個綜合預(yù)后模型，將NPC患者分為三組。Kaplan-Meier曲線分析發(fā)現(xiàn)，這些組的總生存期、無病生存期和遠端無轉(zhuǎn)移生存期存在顯著差異。這些結(jié)果說明，LINC00173在NPC的預(yù)后方面具有重要價值（圖1G-I）。

  圖1

2. LINC00173促進鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力                                                            

接著，研究者通過敲除和過表達LINC00173來研究其在NPC中失調(diào)的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)敲除LINC00173嚴(yán)重阻礙了細(xì)胞增殖和克隆形成能力（圖2A，B），過表達LINC00173則有相反效果（圖2C，D）。此外，敲除LINC00173顯著削弱了細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖2E），而過表達LINC00173則增強了細(xì)胞的遷徙和侵襲能力（2F）。這些結(jié)果表明，LINC00173促進NPC的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，這可能是導(dǎo)致預(yù)后不良的原因。

圖2

3. LINC00173與RAB1B直接結(jié)合

為了研究LINC00173的作用機制，研究者用生物素標(biāo)記的LINC00173正義或反義序列（0173 SS或AS）進行了RNA pull down和質(zhì)譜檢測（LC-MS/MS），尋找LINC00173的互作蛋白。pull down產(chǎn)物的SDS-PAGE銀染結(jié)果顯示有特異性蛋白條帶，質(zhì)譜也檢測到了RAB1B蛋白（圖3A）。RNA pull down WB實驗驗證并確定了LINC00173和RAB1B在NPC細(xì)胞中存在高度相互作用（圖3B）。之后進行的RIP qPCR實驗也觀察到LINC00173明顯富集（圖3C，D）。核質(zhì)RNA提取檢測發(fā)現(xiàn)LINC00173主要定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖3E）。進一步的FISH和免疫熒光（IF）分析發(fā)現(xiàn)，LINC00173和RAB1B蛋白在細(xì)胞質(zhì)中共定位（圖3F），并且LINC00173的敲除或過表達都不會影響RAB1B的mRNA或蛋白質(zhì)水平（圖3G，H）。這些發(fā)現(xiàn)表明LINC00173不會影響RAB1B的表達，可能直接與細(xì)胞質(zhì)中的RAB1B蛋白相互作用。

圖3

4. LINC00173通過RAB1B介導(dǎo)的方式促進PA2G4和SDF4的分泌

RAB1B作為RAB蛋白家族的一員，可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的胞外轉(zhuǎn)運。為了研究LINC00173是否通過調(diào)節(jié)RAB1B介導(dǎo)的胞外轉(zhuǎn)運過程發(fā)揮作用，研究者用質(zhì)譜方法篩選了受LINC00173/RAB1B影響的分泌蛋白。當(dāng)SUNE1細(xì)胞穩(wěn)定干擾LINC00173后，為其更換無血清培養(yǎng)基，16h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液進行LC-MS/MS分析（圖4A），在篩選到的10個差異蛋白（圖4B）中，PA2G4和SDF4差異最大，并且在LINC00173敲除后顯著下降（圖4C）。之后，研究者分別對細(xì)胞裂解物和濃縮上清液中的RAB1B、PA2G4、SDF4蛋白進行了Western-blot檢測，發(fā)現(xiàn)LINC00173敲除并不影響細(xì)胞裂解物中的RAB1B、PA2G4和SDF4蛋白水平，而顯著降低了細(xì)胞上清液中的PA2G4和SDF4水平（圖4D）。那么LINC00173/RABB是否通過胞外途徑調(diào)節(jié)PA2G4和SDF4蛋白的分泌呢？研究者用胞外途徑化學(xué)抑制劑Exo-1處理NPC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PA2G4和SDF4水平顯著下降了（圖4E），表明LINC00173/RABB通過胞外途徑促進PA2G4或SDF4的分泌。接著，研究者將RAB1B過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定干擾LINC00173的NPC細(xì)胞株中，RAB1B的過表達可以逆轉(zhuǎn)PA2G4和SDF4蛋白分泌水平（圖4F）。這些結(jié)果確定了LINC00173可以通過RAB1B介導(dǎo)的胞外途徑中刺激PA2G4和SDF4的分泌。

圖4

5. 敲除PA2G4或SDF4逆轉(zhuǎn)了LINC00173介導(dǎo)的NPC進展

LINC00173/RABB是否通過促進PA2G4和SDF4蛋白分泌來促進NPC的惡性進展呢？研究者將LINC00173過表達質(zhì)粒與PA2G4-shRNA或SDF4-shRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到NPC細(xì)胞中，生長曲線和克隆形成實驗結(jié)果顯示，敲低PA2G4或SDF4顯著逆轉(zhuǎn)了LINC00173過表達誘導(dǎo)的細(xì)胞生長和增殖作用（圖5A-D）。此外，過表達LINC00173顯著增加了細(xì)胞的遷移和侵襲能力，敲低PA2G4或SDF4后細(xì)胞侵襲能力減弱（圖5E-F）。這些數(shù)據(jù)表明，LINC00173可以通過促進PA2G4和SDF4的分泌來促進NPC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

圖5

6. LINC00173敲低對NPC腫瘤的體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移抑制作用

接下來，研究者利用皮下腫瘤生長模型進一步分析LINC00173在NPC體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移中的作用。結(jié)果顯示，敲低LINC00173顯著延緩了腫瘤的生長，與對照組相比，腫瘤的體積、大小和重量都減少了（圖6A-C）。接著，研究者建立腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，并通過尾靜脈注射建立肺轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果顯示，敲低LINC00173的腹股溝淋巴結(jié)較小、體積減?。▓D6D-F）。腫瘤H&E染色表明，敲低LINC00173的腫瘤侵襲性較低，對皮膚或肌肉的侵襲能力減弱（圖6G），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯低于對照組（圖6H，I）。此外，在肺轉(zhuǎn)移模型中，LINC00173基因敲低組在肺表面表現(xiàn)出較小的結(jié)節(jié)（圖6J），轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較對照組明顯減少和縮?。▓D6K，L）。

圖6

●   總結(jié)

本研究確定了LINC00173在鼻咽癌中上調(diào)，并與預(yù)后不良相關(guān)，通過RNA pull down實驗篩選并驗證了LINC00173的互作蛋白RAB1B，闡明了LINC00173通過RAB1B的胞外轉(zhuǎn)運功能，促進PA2G4或SDF4分泌，在體內(nèi)和體外促進NPC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

輝駿生物實驗外包服務(wù)商，10年專注科研實驗，專業(yè)提供全方位蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白/核酸互作、代謝組學(xué)、分子/細(xì)胞生物學(xué)、lncRNA專題實驗等科研服務(wù)。輝駿自有蛋白質(zhì)檢測平臺，對IP和pull down產(chǎn)物等微量蛋白的質(zhì)譜鑒定有充足的把控能力，對后續(xù)的生物信息分析有獨到的見解。

目前，我們已為上千位客戶在Nature、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發(fā)表大量高分文章（點擊查看客戶文獻），歡迎各位咨詢RNA pull down MS檢測實驗，服務(wù)電話：4006991663！