中文標(biāo)題：HOXD9-介導(dǎo)的PAXIP1-AS1通過PABPC1/PAK1調(diào)控胃癌的進(jìn)展

發(fā)表期刊：Cell Death Dis

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：9.685

發(fā)表時(shí)間：2023年5月

合作單位：南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院

運(yùn)用技術(shù)：RNA pull down MS、RNA免疫沉淀（RIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）、LC-MS/MS質(zhì)譜檢測（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景：

胃癌（GC）患者的預(yù)后五年生存率不到25%，高死亡率歸因于診斷不及時(shí)、臨床表現(xiàn)延遲和侵襲轉(zhuǎn)移率高，因此需要更好地了解GC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，據(jù)報(bào)道，PAXIP1-AS1與癌癥的發(fā)生有關(guān)，然而對其在GC中的作用仍知之甚少。本研究探索了HOXD9/PAXIP1-AS1/PAPPC1/PAK1信號軸在GC轉(zhuǎn)移中的重要性，為GC診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的開發(fā)提供了新思路。

● 研究結(jié)果

1、PAXIP1-AS1受到HOXD9的轉(zhuǎn)錄抑制

先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子HOXD9促進(jìn)胃腸癌EMT誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，因此本項(xiàng)目首先采用WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了HOXD9蛋白在GC細(xì)胞系中的表達(dá)，其在AGS、NCI-N87、SNU-719、MKN-45、HGC-27、BGC-823、MGC803和SGC-7901細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于GES-1細(xì)胞系（胃黏膜上皮細(xì)胞），而在MKN-74、SNU-1和SNU-5中表達(dá)較低（圖1A）。HOXD9過表達(dá)細(xì)胞的RNA測序和HGNC數(shù)據(jù)庫分析確定并注釋了14個(gè)差異表達(dá)的lncRNA（圖1B），TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)低表達(dá)PAXIP1-AS1的GC患者的總生存期較短，因此選擇PAXIP1-AS1做進(jìn)一步研究。HOXD9的過表達(dá)（圖1C1）或敲低（圖1C2）證實(shí)了HOXD9與PAXIP1-AS1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

接著，軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)HOXD9在PAXIP1-AS1啟動子區(qū)有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖1D，E），接著分別使用HOXD9抗體和正常兔IgG對GC細(xì)胞進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）分析，PCR結(jié)果表明HOXD9蛋白只與第二預(yù)測位點(diǎn)（?1503 to ?1513）結(jié)合（圖1F）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，第二結(jié)合位點(diǎn)對于HOXD9抑制PAXIP1-AS1至關(guān)重要（圖1G）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HOXD9與特定的PAXIP1-AS1啟動子結(jié)合以抑制其轉(zhuǎn)錄。

圖1

2、PAXIP1-AS1抑制GC進(jìn)展

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示，與正常組（n=211）相比，GC組（n=408）組織中PAXIP1AS1的表達(dá)較低（圖1A），qPCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測了PAXIP1-AS1在75對匹配的正常和癌性胃組織中的表達(dá)，結(jié)果表明PAXIP1-AS在GC中顯著下調(diào)（圖2B，C）。此外，PAXIP1-AS1在除BGC-823外的大多數(shù)GC細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)（圖2D），且與HOXD9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖1A）。為了確定PAXIP1-AS1在GC細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，對GES-1和MKN-74細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)/核分離，發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)高于細(xì)胞核（圖2E），原位雜交（ISH）對10對正常和GC組織的研究得到了一致的結(jié)果（2F）。GC組織樣本中PAXIP1-AS的檢測結(jié)果表明，PAXIP1-AS1的表達(dá)與腫瘤侵襲顯著相關(guān)（圖2G、H），這些發(fā)現(xiàn)表明PAXIP1-AS1在GC進(jìn)展中作為腫瘤抑制因子起作用。

圖2

3、PAXIP1-AS1在體外和體內(nèi)抑制GC細(xì)胞的生長、遷移和侵襲

為了評估PAXIP1-AS對體外細(xì)胞功能的影響，首先在AGS和MKN-45細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PAXIP1-AS1質(zhì)粒過表達(dá)PAXIP1-AS1，在MKN-74細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA敲低PAXIP1-AS1。EdU熒光染色對細(xì)胞增殖率的測定結(jié)果表明，PAXIP1-AS1過表達(dá)組中的陽性細(xì)胞平均百分比顯著降低（圖3A），敲低組則相反（圖3B）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，過表達(dá)或敲低PAXIP1-AS1分別導(dǎo)致GC細(xì)胞增殖減少或增加（圖3C,D）。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1敲除細(xì)胞有更高的遷移和侵襲活性（圖3G–J）。細(xì)胞劃痕結(jié)果顯示PAXIP1-AS1過表達(dá)導(dǎo)致傷口閉合顯著減慢，反之亦然（圖3K,L）。

為了研究PAXIP1-AS1對體內(nèi)腫瘤生長的影響，將PAXIP1-AS1過表達(dá)的MKN-74細(xì)胞和對照細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)建立皮下異種移植模型，結(jié)果顯示 PAXIP1-AS1過表達(dá)組的腫瘤體積更小，腫瘤增殖率也顯著降低（圖3F）。接著，研究者將PAXIP1-AS1過表達(dá)細(xì)胞和對照細(xì)胞注射到裸鼠尾靜脈，建立尾靜脈-肺轉(zhuǎn)移模型（圖3M），發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1過表達(dá)細(xì)胞在肺中形成的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)更少（圖4I），IHC實(shí)驗(yàn)確定了EMT標(biāo)記物E-鈣粘蛋白和MMP2的表達(dá)情況：E-鈣粘蛋白在癌組織中表達(dá)較低，MMP2則較高。將PAXIP1-AS1過表達(dá)細(xì)胞和對照細(xì)胞分別注射到小鼠脾臟中建立脾內(nèi)肝轉(zhuǎn)移模型，三周后解剖肝臟，發(fā)現(xiàn) PAXIP1-AS1組中觀察到的轉(zhuǎn)移瘤比對照更少（圖3N,O）。

這些研究結(jié)果表明PAXIP1-AS1的過表達(dá)能抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖3

4、PAXIP1-AS1過表達(dá)顯著抑制了HOXD9誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移

先前多個(gè)研究已報(bào)道HOXD9通過EMT改變促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，因此本研究進(jìn)一步探討了PAXIP1-AS1是否參與HOXD9介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和EMT。當(dāng)過表達(dá)HOXD9后（圖4A），細(xì)胞呈現(xiàn)EMT特征，即紡錘狀的成纖維細(xì)胞形態(tài)，而共轉(zhuǎn)染HOXD9和PAXIP1-AS1會導(dǎo)致EMT的逆轉(zhuǎn)（圖4B）。采用鬼筆環(huán)肽染色F-actin發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)表達(dá)HOXD9相比，同時(shí)過表達(dá)HOXD9和PAXIP1-AS1會導(dǎo)致粗的F-actin蛋白絲部分解聚（圖4C），這與EMT誘導(dǎo)的表型相反。

HOXD9過表達(dá)導(dǎo)致MMP2和Vimentin上調(diào)， E-cadherin下調(diào)；與之相比，同時(shí)過表達(dá)HOXD9和PAXIP1-AS1的細(xì)胞中的MMP2和Vimentin表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)增加（圖4D）。Transwell技術(shù)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕技術(shù)實(shí)驗(yàn)表明， HOXD9過表達(dá)增加了GC細(xì)胞的侵襲和遷移潛力，同時(shí)過表達(dá)HOXD9和PAXIP1-AS1逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象（圖4E-G）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HOXD9-PAXIP1-AS1信號通路調(diào)控GC細(xì)胞的EMT、遷移和侵襲。

圖4

5、GC細(xì)胞中的PAXIP1-AS1與PABPC1蛋白相互作用

研究者通過RNA pull down技術(shù)和質(zhì)譜(MS)方法鑒定了312個(gè)PAXIP1-AS1的潛在結(jié)合蛋白（圖5A），其中參與多基因3′UTR調(diào)控的PABPC1蛋白引起了他們的注意。RNA pull down和WB檢測表明PAXIP1-AS1可以與PABPC1結(jié)合（圖5B），RNA免疫沉淀（RIP）技術(shù)實(shí)驗(yàn)也再次確認(rèn)了它們間的相互作用（圖5C）。接著，研究人員采用一系列PAXIP1-AS1突變體（圖5D）來進(jìn)行RNA pull down WB實(shí)驗(yàn)，最終確定PAXIP1-AS1的F1–F4區(qū)域與PABPC1蛋白結(jié)合。此外，構(gòu)建帶His標(biāo)簽的PABPC1全長及五個(gè)缺失突變體（圖5F）進(jìn)行RIP qPCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1主要與PABPC1中的RRM4和PABC結(jié)構(gòu)域結(jié)合（圖5G）。

那么PAXIP1-AS1與PABCS1的結(jié)合是否影響其蛋白的穩(wěn)定性呢？研究發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1過表達(dá)導(dǎo)致PABPC1蛋白質(zhì)水平減少，但其mRNA水平未受影響（圖5H、I）。蛋白穩(wěn)定性測定發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1過表達(dá)促進(jìn)了PABPC1蛋白的降解（圖5J）。蛋白酶體抑制劑MG132顯著減弱了PAXIP1-AS1過表達(dá)導(dǎo)致的PABPC1蛋白降解(圖5K)。泛素化實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAXIP1-AS1促進(jìn)了PABPC1的泛素化(圖5L)。這些結(jié)果表明，PAXIP1-AS1可以直接與PABPC1蛋白結(jié)合，并通過泛素化促進(jìn)其降解，從而調(diào)節(jié)其表達(dá)。

圖5

6、PAXIP1-AS1與PABPC1相互作用以調(diào)控GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

研究者繼續(xù)調(diào)查了PAXIP1-AS1和PABPC1之間的相互作用是否具有功能。在體外GC細(xì)胞中，PAXIP1-AS1過表達(dá)增加了上皮標(biāo)志物(E-cadherin)的表達(dá)，同時(shí)降低了間充質(zhì)標(biāo)志物（Vimentin和MMP2）的表達(dá)，降低了細(xì)胞遷移的數(shù)量和速率；PAXIP1-AS1和PABPC1共轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)了PAXIP1-AS1對GC細(xì)胞中EMT、細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用（圖6A–D）。此外，構(gòu)建多個(gè)慢病毒感染細(xì)胞系并分別注射到裸鼠尾靜脈中（圖6E），結(jié)果發(fā)現(xiàn)靜脈接種PAXIP1-AS1細(xì)胞導(dǎo)致小鼠肺部可見腫瘤數(shù)量顯著減少，這與轉(zhuǎn)移基因座數(shù)量減少有關(guān)。相反，接種PAXIP1-AS1+PABPC1細(xì)胞則觀察到轉(zhuǎn)移基因座數(shù)量的增加（圖6F）?？笶-cadherin和MMP2蛋白的IHC染色進(jìn)一步證實(shí)了裸鼠肺中GC轉(zhuǎn)移的存在（圖6G，H）。PAXIP1-AS1過表達(dá)組的肝臟轉(zhuǎn)移瘤更少，而PAXIP1-AS1+PAPPC1組逆轉(zhuǎn)了這一效果（圖6I、J）。這些數(shù)據(jù)表明PAXIP1-AS1與PABPC1協(xié)同調(diào)節(jié)GC細(xì)胞遷移和EMT。

圖6

7、PABPC1通過增強(qiáng)PAK1 mRNA的穩(wěn)定性促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移

由于PABPC1常結(jié)合mRNA來起調(diào)控作用，因此研究者使用AURA數(shù)據(jù)庫預(yù)測了PABPC1的結(jié)合基序（圖7A）并確定了PAPC1可能結(jié)合的mRNA。使用siRNA敲低PABPC1，qPCR檢測發(fā)現(xiàn)PAK1 mRNA的變化最顯著（圖7B）。放線菌素D阻斷mRNA合成后，PABPC1干擾細(xì)胞的PAK1 mRNA半衰期更短，表明PABPC1在轉(zhuǎn)錄后水平上增強(qiáng)了PAK1 mRNA的穩(wěn)定性（圖7C）。RIP qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PAK1 mRNA在PABPC1-RNA結(jié)合復(fù)合物中有較高富集（圖7D）。野生型PAK1 3′UTR和突變型PAK1 3′UTR（突變PABPC1結(jié)合位點(diǎn)）的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PABPC1可以與PAK1 3′UTR結(jié)合，從而提高其穩(wěn)定性（圖7E-F）。在PABPC1過表達(dá)細(xì)胞中干擾PAK1，可以通過EMT抑制PABPC1誘導(dǎo)的GC侵襲和轉(zhuǎn)移（圖7G–L）。WB技術(shù)檢測了PAXIP1-AS1、PABPC1和PAK1表達(dá)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示PAXIP1-AS上調(diào)顯著降低了PAK1的表達(dá)（圖7M），表明PAXIP1-AS1參與調(diào)控GC細(xì)胞中PABPC1和PAK1的表達(dá)。

這些結(jié)果表明，PABPC1通過增強(qiáng)GC細(xì)胞中PAK1 mRNA的穩(wěn)定性來促進(jìn)轉(zhuǎn)移和EMT。

圖7

8、人類胃樣本中PAXIP1-AS1的表達(dá)與HOXD9、PABPC1和PAK1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

使用siRNA敲低HOXD9的表達(dá)后，PABPC1和PAK1的表達(dá)也顯著降低了（圖8A）。腫瘤樣本中HOXD9、PABPC1和PAK1通常上調(diào)，而PAXIP1-AS1經(jīng)常下調(diào)（圖8B，C）。Pearson相關(guān)分析顯示，GC組織中PAXIP1-AS1和HOXD9（圖8D）、PAXIP1 AS1和PABPC1（圖8G），以及PAXIP1-AS1和PAK1（圖8H）呈負(fù)相關(guān)，而PABPC1和HOXD9之間的正相關(guān)性（圖8E），PAK1和HOXD9（圖8F），以及PAK1和PABPC1（圖8I）呈正相關(guān)。IHC和ISH結(jié)果顯示，GC中HOXD9、PABPC1和PAK1的表達(dá)顯著較高，而PAXIP1-AS1的表達(dá)顯著較低（圖8J）。這些結(jié)果表明，在GC樣品中，PAXIP1-AS1的表達(dá)與HOXD9、PABPC1和PAK1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

圖8

RNA pull down技術(shù)實(shí)驗(yàn)—輝駿服務(wù)內(nèi)容

RNA pull down實(shí)驗(yàn)外包樣本要求

▲注意：以上均為每組樣本的送樣量，如果實(shí)驗(yàn)和對照組用的樣本一致，此樣本量*2。詳細(xì)送樣指南可聯(lián)系輝駿生物索取。

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