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中文標題：口腔鱗狀細胞癌中ENO1與ApoC3結合并通過IL-8/STAT3通路抑制T細胞增殖

發(fā)表期刊：International Journal of Molecular Sciences

中科院分區(qū)：2區(qū)

影響因子：6.208

發(fā)表時間：2022年10月

合作單位：武漢大學

運用技術：GST pull down MS（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

● 研究概述

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）的淋巴結轉移與預后不良有關，但很少有研究探討術后淋巴引流（PLD）與轉移性OSCC的相關性。α-烯醇化酶（ENO1）是一種代謝酶，與OSCC淋巴轉移有關，但是其作用機制尚未闡明。本研究收集了OSCC患者轉移和非轉移淋巴結切除術后的淋巴引流液，研究了ENO1表達與轉移的關系，并通過GST pull down MS實驗找到了與ENO1相互作用的蛋白——載脂蛋白C-III (ApoC3)；它們的結合導致了白細胞介素(IL)-8的產(chǎn)生，進而激活了Jurkat T細胞的STAT3信號通路，促進細胞凋亡，抑制Jurkat T細胞增殖?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)闡明了ENO1在轉移性OSCC中功能的分子機制，并為靶向ENO1治療OSCC提供了新的策略。

● 研究結果

1. ENO1在人OSCC組織中高表達且與臨床病理有相關性

IHC檢測發(fā)現(xiàn)，ENO1在人口腔鱗狀細胞癌（OSCC）中的表達水平比正?？谇徽衬ぃ∟OM）（p<0.001）（圖1A）和口腔上皮發(fā)育不良（OED）（p<0.05，圖1B）中的更高。進一步研究表明，ENO1與OSCC T分期之間沒有明顯的相關性（p>0.05，圖1C，D），但有淋巴結轉移的患者中的ENO1表達高于無淋巴結轉移患者（p<0.05，圖1E），ENO1在轉移性淋巴結中的IHC染色也比非轉移性淋巴結的更強（p<0.05，圖1F，G）。ELISA結果顯示，轉移性OSCC患者PLD中的ENO1水平高于非轉移性OSCC患者（p<0.01，圖2A）。這些結果表明ENO1的高表達與淋巴結轉移狀態(tài)呈正相關。

圖1

2. OSCC中的ENO1與ApoC3相互作用

為了研究ENO1在OSCC淋巴轉移中的作用機制，研究人員使用GST pull down方法捕獲了ENO1在轉移性OSCC患者PLD中的結合蛋白（圖2B，C），并利用質譜（LC-MS/MS）技術對這些結合蛋白進行鑒定，結果顯示有100個蛋白在OSCC PLD中顯著富集，KEGG pathway對這些蛋白進行了分析（圖2D）。對炎癥發(fā)展至關重要的ApoC3蛋白被挑選用于后續(xù)驗證，人OSCC細胞系CAL27和OSCC組織的雙標記免疫熒光結果顯示ApoC3和ENO1在CAL27細胞和OSCC組織中共定位。

圖2

3. ApoC3在OSCC組織中高表達

流式細胞術對OSCC細胞系CAL27和人的永生化口腔上皮細胞系HIOEC中膜ApoC3的檢測顯示，ApoC3在CAL27細胞中的表達更高（圖3A，B，p<0.001）。在激光共聚焦顯微鏡下，ApoC3在CAL27細胞的細胞膜上高度表達，但在HIOEC細胞中少量表達（圖3C）。用IHC染色顯示ApoC3的表達顯著高于NOM（p<0.05，圖3D，E）。此外，ApoC3在轉移淋巴結中的表達顯著高于非轉移淋巴結（p<0.01，圖3F，G），ApoC3的表達與淋巴結轉移呈正相關。聚類分析發(fā)現(xiàn)ENO1和ApoC3之間的表達趨勢相似（圖3H），Pearson相關分析說明兩者之間的相關性（p=0.0479，r=0.2966，圖3I）。

圖3

4. ENO1與ApoC3結合介導促炎細胞因子的產(chǎn)生

設計三種靶向ENO1（ENO1siRNA-1/2/3）干擾的siRNA，干擾效率檢測確定了ENO1siRNA-2的效果最好（圖4A）。通過QAH-INF-1細胞因子抗體陣列測試ENO1與ApoC3結合對CAL27細胞炎性細胞因子產(chǎn)生的影響（圖4B）。結果表明， ApoC3刺激導致CAL27細胞產(chǎn)生的IL-8增加；當ENO1下調時，CAL27細胞產(chǎn)生的IL-8受到抑制（圖4C），ELISA結果與細胞因子抗體陣列結果一致（圖4D）。ELISA結果顯示，對照組和ENO1干擾組的IL-8產(chǎn)生水平?jīng)]有顯著差異，而在用人重組ApoC3蛋白刺激后，這兩組差異顯著，IL-8的產(chǎn)生顯著降低（p<0.01）。

圖4

5. IL-8通過STAT3信號通路抑制T細胞增殖

流式細胞檢測顯示，不同濃度重組IL-8蛋白處理后，Jurkat T細胞的凋亡率隨IL-8濃度的升高而增加（圖5A），當IL-8為0.8μg/mL時，凋亡率最高（p<0.001，圖5B），且IL-8對Jurkat T細胞的Ki67表達具有抑制作用（p<0.001，圖5C，D）。CCK-8結果顯示，細胞增殖隨IL-8濃度的增加而受到抑制（圖5E）。為了研究IL-8調控Jurkat T細胞的潛在機制，Western blot和流式細胞術檢測了p-STAT3的表達。通過與CAL27細胞共培養(yǎng)，Jurkat T細胞中的p-STAT3水平升高，但經(jīng)過IL-8中和抗體處理后，p-STAT3的水平下降(圖5F,G)。此外，IL-8受體CXCR1/2的抑制劑reparixin不同程度的降低了p-STAT3的水平（p<0.05，圖5H，I）。用重組IL-8蛋白刺激后，Jurkat T細胞中的p-STAT3水平增加（p<0.001，圖5J，K）。在用下降后，STAT3抑制劑恢復了IL-8處理對Ki67水平的抑制（p<0.01，圖5L，M）。這些結果表明，STAT3在IL-8對Jurkat T細胞的調節(jié)過程中起重要作用，IL-8促進STAT3的磷酸化并損害Jurkat T細胞的增殖。

圖5

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