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中文標(biāo)題：MafF通過circ-ITCH/miR-224-5p軸調(diào)控，并在肝癌中作為腫瘤抑制因子

發(fā)表期刊：Oncol Res

影響因子：4.362

發(fā)表時間：2020年7月

合作單位：廣州醫(yī)科大學(xué)

運用技術(shù)：慢病毒載體構(gòu)建，慢病毒包裝，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建（由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 研究背景

肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上第六大常見癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡率的第二大原因。臨床上，HCC的特點是侵襲性強，治療機會有限，預(yù)后不良?？紤]到HCC早期評估和治療的復(fù)雜性，進一步了解HCC進展的調(diào)控機制和上游信號分子對于早期診斷和治療具有重要意義。MafF是堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子Maf（肌肉腱P膜纖維肉瘤癌基因）家族的成員。與其他兩種小Maf蛋白（MafG和MafK）類似，MafF缺乏明顯的反式激活結(jié)構(gòu)域，但可以與小Mafs同源二聚化或與其他bZIP蛋白異源二聚化，如Cap'n'Collar（CNC）家族成員p45 NFE2，Nrf1和Nrf25,6。通過作為轉(zhuǎn)錄抑制因子或激活因子的同二聚體或異二聚體，MafF在基因表達(dá)的控制中起重要作用，并參與多種生理和病理過程，如造血，細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和癌癥發(fā)展。

● 研究結(jié)果

1.     MafF在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)降低

為了探討MafF在HCC中的作用，研究者首先通過免疫組化檢測76對HCC和癌旁組織中MafF蛋白的表達(dá)。如圖1A所示，MafF蛋白主要分布在細(xì)胞核中，其在HCC組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織。此外，MafF的表達(dá)隨著HCC的進展而降低(圖1B)。接下來，研究者檢測了MafF蛋白在人正常肝細(xì)胞L-O2和3個人HCC細(xì)胞系SMMC7721、Huh7和Hep3B中的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，MafF蛋白在HCC細(xì)胞中的表達(dá)低于L-O2細(xì)胞(圖1C)。

圖1

2. MafF過表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

考慮到MafF在HCC中下調(diào)，研究者進一步通過在HCC細(xì)胞中過表達(dá)MafF來研究其功能。通過慢病毒感染和嘌呤霉素篩選建立了Maff高表達(dá)SMMC7721和Hep3B細(xì)胞系，QRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，Maff mRNA和蛋白水平在兩個細(xì)胞中均顯著升高(圖2A和B)。CCK-8檢測結(jié)果顯示，Maff過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖(圖2C和D)；Maff過表達(dá)細(xì)胞的集落數(shù)明顯少于對照細(xì)胞(圖2E和F)。通過流式細(xì)胞儀分析Maff對肝癌細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)MafF過表達(dá)顯著增加了SMMC7721和Hep3B細(xì)胞的凋亡率(圖3)，提示Maff過表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖2

圖3

3. MiR-224-5p可下調(diào)肝癌細(xì)胞Maff的表達(dá)

MiRNA可以影響mRNA的穩(wěn)定性或mRNA的翻譯，主要是通過結(jié)合特異性mRNA的3’-UTR來實現(xiàn)的。研究者首先使用了四種miRNA靶標(biāo)預(yù)測工具(Miranda、Targetcan、miRWalk和Starbase)來研究可能與Maff mRNA結(jié)合的miRNA，四個數(shù)據(jù)庫中重疊的兩個miRNA：miR-224-5P和miR-760，被選擇用于進一步研究(圖4A和B)。MiRNA模擬轉(zhuǎn)染后，mir-224-5P和miR-760的表達(dá)均顯著增加(圖4C和D)。熒光素酶報告分析結(jié)果顯示，與對照miR-NC轉(zhuǎn)染組相比，miR-224-5p模擬物和MafF 3’-UTR-WT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光素酶活性受到抑制。而MafF 3’-UTR WTt與miR-224-5p或miR-NC共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性無明顯差異。然而，miR-760模擬轉(zhuǎn)染并不影響所有組細(xì)胞的熒光素酶活性(圖4E和F)，這些結(jié)果表明miR-224-5p能直接靶向Maff mRNA，而miR-760不能。Western blot分析進一步證實，miR-224-5p顯著下調(diào)MafF蛋白的表達(dá)(圖4G和H)。綜上所述，miR224-5p直接靶向MafF mRNA，并降低Maff的蛋白水平。

圖4

4. CircRNA circ-ITCH是HCC中miR-224-5p的分子海綿

據(jù)報道，circ-ITCH作為miR-224-5P的分子海綿，在膀胱癌中消除了miR-224-5P的致癌作用。為了探討circ-ITCH是否通過海綿作用于miR-224-5p來影響HCC的進展，研究者首先檢測了circ-ITCH和miR-224-5p在HCC中的表達(dá)。QRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，circ-ITCH在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且隨著肝癌的進展而降低(圖5A)，這與Maff的表達(dá)模式一致。之后檢測了L-O2和三個肝癌細(xì)胞系中circ-ITCH和miR224-5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與L-O2細(xì)胞相比，HCC細(xì)胞表現(xiàn)出較低的circ-ITCH水平和較高的miR-224-5p水平(圖5B)。隨后的相關(guān)分析表明，肝癌組織中circ-ITCH水平與miR-224-5p水平呈負(fù)相關(guān)(圖5C)。RNA pull down結(jié)果顯示，與對照組相比，circ-ITCH探針中miR-224-5p明顯富集。這些結(jié)果表明，circ-ITCH是miR-224-5P的分子海綿，并與其直接結(jié)合(圖5D)。

圖5

5. Circ-ITCH/miR-224-5p軸通過調(diào)節(jié)MafF表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡

基于上述結(jié)果，研究者推測MafF的腫瘤抑制作用可能由circ-ITCH/miR-224-5p軸調(diào)控。為了驗證推測，研究者通過慢病毒感染構(gòu)建了circ-ITCH過表達(dá)細(xì)胞，結(jié)果顯示circ-ITCH的強制表達(dá)顯著上調(diào)了MafF蛋白表達(dá)水平（圖6A-F），促進細(xì)胞增殖（圖6G）并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖6H）。挽救實驗結(jié)果顯示，miR-224-5p轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)了circ-ITCH誘導(dǎo)的MafF蛋白的上調(diào)（圖6B，C，E和F），部分抵消了circ-ITCH的抗增殖和促凋亡作用（圖6G，H和I）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)反映了MafF在HCC中的表達(dá)降低可以通過circ-ITCH/miR-224-5p軸調(diào)節(jié)，并因此促進腫瘤進展（圖6J）。

圖6