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Sun C. et al: Oncofetal gene SALL4 reactivation by hepatitis B virus counteracts miR-200c in PD-L1-induced T cell exhaustion

乙型肝炎病毒激活癌胎基因SALL4在PD-L1誘導(dǎo)的T細胞耗竭中抵消miR-200c

發(fā)表期刊Nature Communication

影響因子17.694

發(fā)表時間:2018年9月

合作單位:中國科學(xué)院先天免疫與慢性病重點實驗室

運用技術(shù)shRNA慢病毒載體構(gòu)建(由輝駿生物提供技術(shù)支持)



研究背景

慢病毒感染和腫瘤微環(huán)境可促使浸潤的病毒特異性或腫瘤特異性T細胞衰竭,從而嚴重損害這些細胞的增殖能力和效應(yīng)功能,使免疫反應(yīng)無法消除病毒或排斥腫瘤。其中,肝臟病毒感染是促進肝細胞癌(HCC)發(fā)展和進展的主要因素。據(jù)報道,大多數(shù)HCC病例是HBV或丙型肝炎病毒持續(xù)感染的結(jié)果。CD8+T細胞的激活不僅通過識別感染肝細胞表面呈現(xiàn)的表位來調(diào)節(jié),還通過T細胞表面的共抑制和共刺激分子、包括肝細胞在內(nèi)的抗原呈遞細胞(APC)上的配體相互作用介導(dǎo)的正負信號之間的平衡來調(diào)節(jié)。臨床資料表明,PD-1/PD-L1的表達與肝癌患者的腫瘤大小、血管浸潤和腫瘤分期呈正相關(guān)。然而迄今為止,HBV感染如何誘導(dǎo)PD-L1表達,宿主因素是否控制了HBV誘導(dǎo)的PD-L1表達,以及潛在的相互作用機制等仍然不清楚。

 

MicroRNAs(MiRNA)通過指導(dǎo)mRNA翻譯的降解或抑制,在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因,導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平的降低。其被認為是HBV相關(guān)HCC預(yù)后的潛在生物標志物,miR141和miR-200家族在HCC膽管腫瘤血栓患者中下調(diào),并作為無病生存的獨立預(yù)測因子。然而,MiRNA是否參與了PD-L1表達的調(diào)節(jié),HBV是否與MiRNA有內(nèi)在的抵消,以及它們之間的相互作用如何影響抗HBV免疫,都還需要進一步研究。Sal樣蛋白4 (Sall4)是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)胚胎干細胞的多能性和自我更新14,15。SALL4作為一種在許多人類癌癥中表達的重要轉(zhuǎn)錄因子,其高表達與侵襲性HCC和不良預(yù)后相關(guān)。然而,HBV是否具有激活成人肝臟中SALL4表達的功能,以及SALL4和miRNA是否相互作用以調(diào)節(jié)PD-L1的表達仍不清楚。

 

研究結(jié)果

1.肝癌組織中SALL4和PD-L1與miR-200c呈負相關(guān)

科學(xué)界已經(jīng)認識到PD-L1在多種惡性腫瘤中的作用,在微陣列分析中,miR-200c被報道為HCC的miRNA指示物之一,SALL4在HCC中高表達且預(yù)后不良。分析顯示,miR-200c直接靶向PD-L1的3‘-UTR;另一方面,轉(zhuǎn)錄因子SALL家族調(diào)控miR-200c在miR-200c啟動子區(qū)域內(nèi)的三個可能的結(jié)合位點的表達(圖1A)。免疫組織化學(xué)分析(圖1B)結(jié)果顯示98例肝癌患者腫瘤組織中PD-L1和SALL4在瘤周和瘤中心的表達,發(fā)現(xiàn)癌中心區(qū)SALL4和PD-L1的表達均顯著增高(圖1C,D)。原位雜交顯示腫瘤中心miR-200c的表達密度顯著高于瘤周(圖1E)。值得注意的是,雖然SALL4、PD-L1和miR200c的表達均有顯著增加,但這三個分子的差異極大,與腫瘤中心區(qū)域相比,SALL4和PD-L1的表達明顯升高,而miR-200c的表達相對較低,而SALL4和PD-L1的表達是平行的(圖1F),提示在HCC進展過程中SALL4、miR-200c和PD-L1之間可能存在密切的關(guān)系。

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圖1


研究者分析了每個HCC患者腫瘤中心區(qū)域SALL4、miR-200c和PD-L1表達之間的關(guān)系,在3例有代表性的患者中,miR-200c的低表達明顯伴隨著SALL4或PD-L1的高密度,而miR-200c的高表達使SALL4或PD-L1的密度保持較低(圖2A),導(dǎo)致SALL4和miR-200c或miR-200c和PD-L1之間存在高度顯著的兩對負相關(guān),同時SALL4和PD-L1表達之間存在正相關(guān)(圖2B);而在瘤周區(qū)域,這些分子之間不具有統(tǒng)計相關(guān)性(圖2C,D)。接下來,研究者利用QRT-PCR技術(shù)檢測了8例新鮮肝癌組織中miR-200c的表達,結(jié)果顯示miR-200c的表達與SALL4或PD-L1的積分光密度(IOD)/面積呈負相關(guān)(圖2E)。研究者進一步檢測了可能靶向PD-L1的miR-200A和miR-383的表達,并分析了它們與肝癌患者SALL4和PD-L1表達的關(guān)系,結(jié)果證實了miR-200c與SALL4或PD-L1相互作用的特異性。

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圖2


2. SALL4和miR-200c與總生存期相關(guān)

研究者對SALL4和miR-200c在腫瘤中心區(qū)域的潛在預(yù)后價值進行了評估。統(tǒng)計學(xué)分析顯示,PD-L1(積分光密度/面積)與腫瘤中心的總生存率(OS)呈負相關(guān)(圖3A),而在瘤周無相關(guān)性(圖3B);腫瘤中心區(qū)域PD-L1的高表達與肝癌患者較短的OS顯著相關(guān)(圖3C)。在同一HCC組中,miR-200c的表達與OS在腫瘤中心和瘤周中也存在正相關(guān)(圖3D,E),且miR-200c密度越高,OS預(yù)后越好(圖3F)。此外,與PD-L1相似,腫瘤中心區(qū)域SALL4的表達與OS呈負相關(guān)(圖3G),而與瘤周區(qū)域無相關(guān)性(圖3H),表明腫瘤中心區(qū)域SALL4高表達的患者OS較短(圖3I)。此外,綜合分析顯示,SALL4降低而miR-200c升高(圖3J)、SALL4降低而PD-L1降低(圖3K)、PD-L1降低而miR-200c升高(圖3L)的患者的OS顯著延長。這些發(fā)現(xiàn)證明了SALL4或miR-200c在腫瘤中心區(qū)域的預(yù)后價值,可能成為一項有前途的肝癌生存預(yù)測指標。

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圖3


3. miR-200c下調(diào)HBV誘導(dǎo)的PD-L1表達

HBV慢性感染是肝癌發(fā)生的關(guān)鍵因素,為研究其潛在機制,研究者檢測了HBV +HLCZ01細胞中轉(zhuǎn)染miR-200c、miR-200a和miR-383的模擬物或抑制劑后PD-L1的表達,這些模擬物或抑制劑在HBV+HLCZ01細胞中均減少,并且有可能靶向PD-L1的3?-UTR(圖1A)。miR-200c模擬物顯著降低PD-L1表達,miR-200c抑制劑顯著增強PD-L1表達,而miR-200a和miR-383模擬物則對PD-L1水平無顯著影響(圖4A)。miR-200c模擬物和抑制劑對PD-L1表達的影響是劑量依賴性的(圖4B)。為了進一步證實miR-200c直接靶向PD-L1的3?-UTR,研究者進行了熒光素酶報告實驗。結(jié)果顯示,miR-200c模擬物顯著降低熒光素酶活性,而miR-200c抑制劑顯著增強熒光素酶活性。這些結(jié)果表明,miR-200c直接靶向PD-L1的3?-UTR。

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圖4


為了探討miR-200c是否能拮抗HBV,從而影響PD-L1的表達,研究者用HBV感染細胞,并檢測miR-200c的相對表達,結(jié)果顯示細胞中miR-200c的表達受到顯著抑制(圖4D),表明HBV抑制了miR-200c的表達。研究者還將miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染到HBV +HLCZ01細胞中,發(fā)現(xiàn)miR-200c幾乎完全消除了HBV介導(dǎo)的PD-L1表達上調(diào)(圖4E),表明miR-200c阻礙HBV介導(dǎo)的PD-L1表達。使用HepaRG細胞系的另一個體外HBV感染模型也獲得了類似的結(jié)果(圖4F)。研究者構(gòu)建了一個miR-200c過表達載體,將其注射到HBV持續(xù)感染的小鼠體內(nèi)。正如預(yù)期的那樣,HBV +小鼠中的miR-200c表達水平顯著低于HBV -小鼠(圖4G)。相反,miR-200c過表達顯著減弱HBV誘導(dǎo)的肝細胞PD-L1表達上調(diào)(圖4H)。這些結(jié)果表明,HBV和miR-200c在HBV感染的肝細胞內(nèi)PD-L1表達過程中存在拮抗作用。


4. miR-200c逆轉(zhuǎn)HBV陽性小鼠CD8+T細胞耗竭

肝細胞中PD-L1的升高導(dǎo)致了HBV持續(xù)感染小鼠中CD8+T細胞的耗竭。研究者進一步探討了miR-200c在HBV誘導(dǎo)的CD8+T細胞耗竭中的作用,結(jié)果顯示,在小鼠肝臟特異性miR-200c過表達后,小鼠肝臟CD69+CD8+、干擾素-γ+CD8+和CD107a+CD8+T細胞的百分比和對靶細胞的殺傷作用顯著增加,接近了PD-L1阻斷所達到的水平(圖5A-G)。miR-200c過表達小鼠的肝淋巴細胞含有更多的HBc特異性CD8+T細胞(圖5I)、HBc特異性干擾素-γ+CD8+T細胞(圖5J)和HBc特異性記憶CD8+T細胞(圖5K),表明miR-200c過表達的小鼠肝淋巴細胞含有更多的HBc特異性CD8+T細胞(圖5I),特別是更多的HBc特異性干擾素-CD8+CD8+T細胞(圖5J)和更多的HBc特異性記憶CD8+T細胞。

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圖5


5. HBV通過STAT3誘導(dǎo)SALL4下調(diào)miR-200c

通過比較HBV +和HBV -肝癌細胞中STAT3的磷酸化水平,研究者發(fā)現(xiàn)HBV促進了STAT3的激活(圖6A)。進一步做DNA序列分析,-1.5-kb SALL4啟動子區(qū)域顯示了四個與STAT3結(jié)合的共同序列(圖6B)。用STAT3抑制劑WP1006處理HBV誘導(dǎo)的HLCZ01和HepaRG細胞,然后檢測SALL4蛋白的表達,結(jié)果顯示STAT3抑制劑WP1006顯著降低了HBV誘導(dǎo)的兩種細胞中SALL4的表達(圖6C)。為了證實STAT3在SALL4表達調(diào)控中的作用,研究者構(gòu)建了含有SALL4啟動子或突變啟動子的熒光素酶報告載體。用報告載體轉(zhuǎn)染HLCZ01細胞,同時用STAT3激活的細胞因子IL-6處理HLCZ01細胞,結(jié)果顯示,IL-6刺激可顯著增強SALL4野生型啟動子的活性,而不是突變啟動子的活性,這可能是通過激活STAT3來實現(xiàn)的,因為WP1006抑制STAT3的激活會顯著降低SALL4啟動子的熒光素酶活性(圖6D)。通過染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù),研究者還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性STAT3可以直接與SALL4的啟動子區(qū)域結(jié)合(圖6E),表明HBV的持續(xù)可能通過STAT3誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制因子SALL4下調(diào)miR-200c。正如預(yù)期的那樣,WP1006處理顯著降低了HBV+HLCZ01細胞在基因和蛋白水平上PD-L1的表達(圖6F-G)。

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圖6


接下來,研究者試圖研究SALL4是如何調(diào)控miR-200c轉(zhuǎn)錄的。生物信息學(xué)分析顯示,miR-200c的啟動子區(qū)域內(nèi)有三個推測的SALL家族結(jié)合位點(圖1A)。HBV感染顯著促進了HLCZ01細胞SALL家族,尤其是SALL4在mRNA(上調(diào))和蛋白(下調(diào))水平的表達(圖7A)。進一步分析顯示,沉默SALL4顯著增強miR-200c的表達,并導(dǎo)致HBV誘導(dǎo)的PD-L1表達降低,而SALL4的過表達顯著降低miR-200c的轉(zhuǎn)錄,增強PD-L1的表達(圖7D,E),HBV+HepaRG細胞中的結(jié)果也是類似的(圖7F-H)。后續(xù)的熒光素酶報告和ChIP實驗進一步證實,SALL4抑制了miR-200c的啟動子活性(圖7I),并能直接與miR-200c的啟動子區(qū)域結(jié)合(圖7J)。這些結(jié)果清楚地表明,HBV的持續(xù)促進了轉(zhuǎn)錄抑制因子SALL4的表達,SALL4又通過與啟動子區(qū)域結(jié)合直接抑制miR-200c的表達。

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圖7

6. 沉默Sall4阻礙HBV復(fù)制和CTL耗盡

為了進一步證實SALL4在體內(nèi)促進HBV持續(xù)存在和HCC進展中的作用,研究者沉默SALL4基因,以觀察其對HBV持續(xù)存在小鼠中HBV感染或持續(xù)的影響(圖8A,B)。與HBV?小鼠相比,持續(xù)感染HBV的小鼠SALL4和PD-L1的表達較高,miR-200c的轉(zhuǎn)錄較低,而沉默SALL4則顯著增強miR-200c的轉(zhuǎn)錄并降低PD-L1的表達(圖8C,D)。此外,沉默Sall4顯著增加干擾素-γ+CD8+T細胞的百分比,降低CD8+T細胞上PD-1的表達,抑制CD8+T細胞的凋亡(圖8E),同時降低乙肝病毒持續(xù)存在小鼠的HBsAg和HBeAg水平(圖8F)。

 

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圖8


研究進一步證實,在HBV+HCC患者中,肝癌細胞中SALL4的重新激活與CD8+T細胞耗竭有關(guān)。研究者采用免疫熒光染色法檢測新鮮肝癌患者瘤周和瘤中心的SALL4表達、PD-1表達和CD8+T細胞浸潤情況,結(jié)果顯示,SALL4在腫瘤中心區(qū)域的表達明顯高于瘤周區(qū)域,SALL4在中心腫瘤區(qū)域的表達遠高于腫瘤周圍區(qū)域,而腫瘤中心區(qū)域的腫瘤浸潤性CD8+T細胞含量遠低于腫瘤周圍區(qū)域(圖9A);不過盡管腫瘤中心區(qū)域的腫瘤浸潤性CD8+T細胞總數(shù)量減少,中心腫瘤區(qū)域的PD-1+CD8+T細胞含量是遠高于瘤周區(qū)域的(圖9A)。此外,統(tǒng)計分析表明,SALL4表達與腫瘤浸潤性PD-1+CD8+T細胞之間存在正相關(guān)(圖9B),這增加了肝細胞SALL4在HBV+HCC進展過程中通過表達PD-L1參與PD-1+CD8+T細胞衰竭的可能性。

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圖9

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