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中文標(biāo)題：泛素特異性蛋白酶3(USP3)通過(guò)與SUZ12相互作用和去泛素化促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲

發(fā)表期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：12.658

發(fā)表時(shí)間：2019年

合作單位：深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科

運(yùn)用技術(shù)：iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

泛素特異性蛋白酶3(USP3)是一種去泛素化酶，在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。USP3的異常表達(dá)可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。然而，有關(guān)USP3促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的研究仍然少之又少，因此，了解USP3促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的有關(guān)機(jī)制將為胃癌的治療提供新的選擇。

● 研究結(jié)果

1. 胃癌患者USP3表達(dá)增高與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后不良相關(guān)

為了確定USP3在胃癌侵襲性中的作用，研究者用Western blotting分析了6對(duì)胃癌組織中USP3的表達(dá)水平。結(jié)果表明，USP3在胃癌組織中的表達(dá)與鄰近的非腫瘤組織相比有顯著差異(圖1A)。RT-PCR法檢測(cè)USP3在6種癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與人胃上皮細(xì)胞系GES-1相比，GC細(xì)胞株AGS、BGC-823、HGC-27和SGC-7901顯示USP3表達(dá)增加，而MGC-803和MKN28則沒(méi)有顯示出USP3表達(dá)增加（圖1B）。應(yīng)用組織芯片技術(shù)(TMA)分析了87例胃癌組織中USP3的表達(dá)，結(jié)果顯示人胃癌組織的免疫染色較強(qiáng)，而正常胃組織的免疫染色較少(圖1C)。臨床病理分析顯示，USP3的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、T分期、臨床TNM分期呈正相關(guān)。Kaplan-Meier法也顯示USP3高表達(dá)的胃癌患者的總體存活率明顯低于低USP3表達(dá)的患者(圖1E)。這些結(jié)果表明，USP3可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起作用。

圖1

2. USP3上調(diào)促進(jìn)胃癌EMT轉(zhuǎn)移

細(xì)胞遷移和侵襲能力增加與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能增加有關(guān)，而與細(xì)胞增殖率無(wú)關(guān)研究者利用Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)研究了USP3對(duì)MGC-803(低表達(dá))以及AGS和BGC-823(高表達(dá))細(xì)胞株侵襲和遷移能力的影響（圖2B）。結(jié)果表明，與載體對(duì)照細(xì)胞相比，USP3的異位表達(dá)促進(jìn)了GC細(xì)胞的侵襲和遷移(圖2A-C)。此外，與MGC-803細(xì)胞相比，AGS和BGC-823細(xì)胞表現(xiàn)出更高的侵襲和遷移率(圖2A-C)。接下來(lái)，研究者合成了3對(duì)USP3 siRNA，結(jié)果顯示USP3的敲除可以抑制AGS和BGC-823細(xì)胞的侵襲和遷移能力(圖2D，E)。這表明USP3的高表達(dá)可能通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力而參與胃癌的轉(zhuǎn)移。研究者還研究了GC細(xì)胞的形態(tài)特征。觀察顯示轉(zhuǎn)染USP3的細(xì)胞發(fā)生了顯著的形態(tài)變化，呈現(xiàn)出EMT過(guò)程中產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞的典型特征(圖2F)。免疫熒光和WB分析顯示，上皮標(biāo)志物E-cadherin在USP3轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，而間充質(zhì)標(biāo)志物vientin(與EMT呈正相關(guān))在USP3轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)(圖2G，H)。一些研究表明，參與Erk1/2/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化水平蛋白已成為EMT的中心特征，在許多腫瘤模型中，EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的初始步驟。為此，研究者進(jìn)行了WB實(shí)驗(yàn)以分析蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。結(jié)果顯示，在USP3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，AKT和ERK1/2的磷酸化水平升高，而p-AKT和ERK1/2的水平降低了siRNA介導(dǎo)的USP3在GC細(xì)胞中的下調(diào)。這些結(jié)果表明，USP3的過(guò)表達(dá)可能通過(guò)誘導(dǎo)EMT過(guò)程促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

圖2

3. Usp3在TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞遷移中的作用

已有報(bào)道表明，TGF-β可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)胚層轉(zhuǎn)化。為了研究TGF-β是否影響USP3的表達(dá)，研究者首先檢測(cè)了TGF-β處理的BCG-823細(xì)胞中USP3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TGF-β處理后USP3的表達(dá)顯著增加，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。此外，TGF-β1顯著抑制EMT標(biāo)志物Ecadherin的表達(dá)。然而，用USP3 siRNA預(yù)先轉(zhuǎn)染細(xì)胞不僅抑制了USP3的表達(dá)，也抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的vimentin 的表達(dá)。這些結(jié)果表明，USP3參與了TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程。

4. USP3促進(jìn)EMT和體內(nèi)轉(zhuǎn)移

通過(guò)裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)觀察USP3對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移的影響，與對(duì)照細(xì)胞相比，USP3過(guò)表達(dá)細(xì)胞組在肺部形成了各種大的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(圖3A)，侵襲能力也顯著增強(qiáng)(圖3B)。組織學(xué)分析證實(shí)BGC-823細(xì)胞存在肺轉(zhuǎn)移(圖3C)。qPCR分析結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，USP3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞導(dǎo)致E-cadherin的表達(dá)顯著降低(圖3D)。這些發(fā)現(xiàn)表明，USP3的異位表達(dá)參與了胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。

圖3

5. USP3對(duì)胃癌細(xì)胞SUZ12蛋白表達(dá)的影響

研究者通過(guò)iTRAQ實(shí)驗(yàn)分析了穩(wěn)定表達(dá)FLAG-USP3融合蛋白的BGC-823細(xì)胞和攜帶空載體的BGC-823細(xì)胞的總蛋白。鑒定出5631種蛋白質(zhì)用于進(jìn)一步的定量分析。其中，當(dāng)USP3基因異位表達(dá)時(shí)，SUZ12表達(dá)上調(diào)。qPCR分析表明，USP3的過(guò)表達(dá)或敲除均對(duì)SUZ12的mRNA水平?jīng)]有影響(圖4A)。然而，USP3上調(diào)時(shí)內(nèi)源性SUZ12表達(dá)增加(圖4B)，USP3降低時(shí)內(nèi)源性SUZ12表達(dá)減少(圖4C)，這表明USP3對(duì)SUZ12表達(dá)的調(diào)控只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察了USP3和SUZ12的定位，結(jié)果顯示這兩種蛋白在GC細(xì)胞中定位于相同的區(qū)域，它們主要分布在細(xì)胞核，少量分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖4D)。這些發(fā)現(xiàn)表明，USP3應(yīng)該是胃癌細(xì)胞中SUZ12的一個(gè)強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)因子。

圖4

6. USP3與SUZ12相互作用并使其去泛素化

研究者將USP3和Myc標(biāo)記的SUZ12載體共轉(zhuǎn)染GC細(xì)胞，以闡明USP3對(duì)SUZ12的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，F(xiàn)LAG標(biāo)記的USP3可以與Myc標(biāo)記的SUZ12在GC細(xì)胞中免疫共沉淀(圖5A)。CoIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，USP3可以與SUZ12相互作用(圖5B)。為了解決USP3是否以及如何穩(wěn)定SUZ12的問(wèn)題，研究者用放線菌酮處理了vector和表達(dá)USP3的BCG-823細(xì)胞(圖5C)。結(jié)果表明，USP3通過(guò)抑制蛋白質(zhì)降解提高了SUZ12的穩(wěn)定性。在BCG-823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FLAG標(biāo)記的USP3或空載體質(zhì)粒，WB分析顯示，USP3的表達(dá)強(qiáng)烈地抑制了SUZ12的泛素化(圖5D)，而抑制USP3的表達(dá)則導(dǎo)致了相反的結(jié)果(圖5E)。這些發(fā)現(xiàn)表明，USP3是一個(gè)通過(guò)與SUZ12相互作用和去泛素化來(lái)控制SUZ12蛋白水平的DUB。

圖5

7. SUZ12參與USP3誘導(dǎo)的GC細(xì)胞遷移、侵襲和EMT

為了探討USP3、SUZ12與細(xì)胞遷移和侵襲能力的關(guān)系，研究者通過(guò)siRNA 下調(diào)了SUZ12在GC細(xì)胞中的表達(dá)(圖6A)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染SUZ12 siRNA 的GC細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著減弱(圖6B，C)。研究者進(jìn)一步研究了SUZ12是否通過(guò)調(diào)節(jié)USP3的表達(dá)來(lái)影響EMT過(guò)程。在顯微鏡下，在USP3細(xì)胞中敲除SUZ12后恢復(fù)了正常的表型(圖6D)。采用IHC法檢測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中USP3和SUZ12的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)USP3和SUZ12在兩例患者癌細(xì)胞的胞核和胞漿中高表達(dá)(圖6E)。此外，WB分析結(jié)果表明，在USP3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，SUZ12的敲除增加了上皮標(biāo)志物Ecadherin的表達(dá)，但降低了間質(zhì)標(biāo)志物vientin、Snail和MMP9的表達(dá)(圖6F)。這些數(shù)據(jù)表明，USP3-SUZ12軸促進(jìn)了GC細(xì)胞的EMT樣表型。

圖6

8. USP3和SUZ12在胃癌細(xì)胞和癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)

為了進(jìn)一步研究USP3和SUZ12之間的關(guān)系，研究者分析了USP3和SUZ12在胃癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，大多數(shù)GC細(xì)胞中USP3和SUZ12的蛋白水平呈正相關(guān)(圖7A)。免疫組織化學(xué)染色顯示，USP3和SUZ12陽(yáng)性信號(hào)在10例胃癌標(biāo)本的癌細(xì)胞中均呈強(qiáng)陽(yáng)性或中等陽(yáng)性表達(dá)(圖7B)。癌組織和正常胃組織中USP3和SUZ12的表達(dá)譜與上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)譜呈負(fù)相關(guān)(圖7B)。此外，Spearman等級(jí)相關(guān)分析證實(shí)，USP3蛋白與SUZ12蛋白在人體組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(圖7C)，USP3和SUZ12蛋白水平與Ecadherin蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(圖7D)。這些結(jié)果表明，USP3和SUZ12的表達(dá)水平呈正相關(guān)，USP3/SUZ12和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

圖7