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中文標(biāo)題：弓形蟲毒力和無毒菌株的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了菌株特異性模式

發(fā)表期刊：Oncotarget

影響因子：5.168

發(fā)表時間：2017年7月

合作單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

運用技術(shù)：iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

頂端復(fù)合體原生動物寄生蟲弓形蟲具有感染多種哺乳動物、鳥類和人類的顯著能力，近年來，人們對弓形蟲卵囊的興趣與日俱增，因為其在弓形蟲傳播到新的宿主和生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用，而且與海洋哺乳動物感染和人類水源性疫情有關(guān)。弓形蟲表現(xiàn)出高度的遺傳多樣性，包括具有不同毒力潛力的菌株。盡管近年來在了解不同基因型弓形蟲不同致病行為的分子基礎(chǔ)方面取得了重大進展，但有關(guān)感染結(jié)局差異的機制尚不完全清楚。

之前的研究發(fā)現(xiàn)了三個弓形蟲克隆系，它們在小鼠中表現(xiàn)出不同的毒力表型，其中I型株對小鼠是致死的，而III型株和III型株的毒力較低。此外，卵囊孢子形成過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)組學(xué)變化已有相關(guān)報道，然而，對促進不同基因型菌株毒力的差異表達蛋白的了解仍然有限。

● 研究結(jié)果

1. 蛋白質(zhì)的鑒定與表達

研究者通過iTRAQ的蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了弓形蟲卵囊中強毒株P(guān)ys和弱毒株P(guān)RU之間的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，共鑒定出2551個蛋白(圖1)。兩個生物副本的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果如圖2所示，COG聚類分析將鑒定的蛋白質(zhì)分為26個類別。如圖3所示，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和伴侶；一般功能預(yù)測；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制；以及能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換是識別最多的五類蛋白質(zhì)。通過比較Pys株和PRU株的相對蛋白質(zhì)表達值來鑒定差異蛋白。結(jié)果顯示共有374個蛋白質(zhì)被歸類為差異蛋白，其中192個蛋白質(zhì)增加，182個蛋白質(zhì)減少；GTP結(jié)合蛋白LEPA(TGME49_307980)、弓形蟲D家族蛋白(TGME49_271590)、TGME49_294600、TGME49_205090和毒物霉素(TGME49_214080)是增加最多的5個蛋白，相反，減少最多的5個蛋白分別是致密顆粒蛋白GRA7(TGME49_203310)、TGME49_203890、桿狀蛋白ROP5(TGME49_308090)、含鋅酒精脫氫酶(TGME49_311780)和紐迪克斯型基序9異構(gòu)體家族蛋白(TGME49_247220)。

  圖1

  圖2

  圖3

2. DEP的功能注釋                                                                                        

為了闡明Pys和PRU菌株卵囊中差異蛋白的生物學(xué)作用，研究者使用GOseq R軟件包進行了GO富集分析。分析將差異增加和減少的GO蛋白分為生物過程、細(xì)胞組成和分子功能三大類，這三個類別中最豐富的前10個GO術(shù)語分別針對增加和減少的蛋白質(zhì)(圖4A-4B)。生物過程中蛋白質(zhì)增加的前五個富集GO術(shù)語包括小分子代謝過程、細(xì)胞蛋白修飾過程、生物合成過程、細(xì)胞氮化合物代謝過程和翻譯過程。相應(yīng)地，蛋白質(zhì)降低的前五個過程分別為細(xì)胞蛋白質(zhì)修飾過程、細(xì)胞氮化合物代謝過程、生物合成過程、碳水化合物代謝過程。

圖4

細(xì)胞成分類別中增加的前三個術(shù)語包括細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合體，而減少的前三個術(shù)語包括胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞。在分子功能類別中，離子結(jié)合項是GO項最顯著富集的項。KEGG途徑富集分析顯示164個差異蛋白具有KEGG正畸(KO)ID，與51條途徑相關(guān)。圖5顯示了27條高度富集的途徑。其中最顯著富集的10條途徑是代謝途徑、次生代謝物的生物合成、抗生素的生物合成、碳代謝、氨基酸的生物合成、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、過氧化物酶體、核糖體、丙酸代謝以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解。

圖5

3. 毒力因子表達的差異

弓形蟲卵囊的許多毒力因子在孢子形成過程中增加，這與孢子化卵囊的感染性有關(guān)。本研究中，研究者檢測到了PYS和PRU菌株的孢子化卵囊之間這些毒力蛋白表達水平的差異。在PYS菌株和PRU菌株的孢子化卵囊中常見的22種毒力蛋白中，只有絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶2C（PP2C）和rhoptry蛋白ROP16（ROP16）在PRU菌株中具有更高的表達水平。相比之下，13種毒力因子包括GRA6，RON4，MIC3，ROP2A，GRA1，RON5，ROP18，MIC2，頂膜抗原AMA1，MIC4，MIC6，ROP5和GRA7在PYS菌株中上調(diào)。此外，ROM4，VP1，SPA-TR，MIC1，PHIL1，MIC8和RON2等七種毒力蛋白的表達水平在兩種菌株之間沒有顯示出任何顯著差異（圖6）。這些結(jié)果表明，毒性PYS菌株的孢子化卵囊比毒性較低的PRU菌株的孢子化卵囊表達更多的毒力因子。

圖6

4. 卵囊壁蛋白的表達

卵囊壁蛋白在弓形蟲卵囊的環(huán)境耐受性中起著重要的作用，可以保護子孢子免受外界環(huán)境和宿主內(nèi)部不利條件的影響。研究者鑒定了22個卵囊壁蛋白，并分析了它們在弓形蟲卵囊兩個不同基因型變異體之間的差異表達，結(jié)果顯示，卵囊壁蛋白增加了10個，減少了3個。大約一半的卵囊壁蛋白在PRU卵囊中的表達水平高于Pys卵囊。與PRU卵囊相比，Pys卵囊中只有3種卵囊壁蛋白過表達。其他9種卵囊蛋白在兩株寄生蟲之間無顯著差異。這些卵囊壁蛋白表達的差異可能與Pys品系和PRU品系卵囊在環(huán)境中生存能力的差異有關(guān)。

5. 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

研究者使用Cytoscape軟件構(gòu)建差異蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)(圖7)。相互作用的程度被定義為確定一個節(jié)點與之直接相連的鄰居的數(shù)量，與其他蛋白質(zhì)高度相互作用的節(jié)點被定義為“HUB”蛋白。其中重要的HUB蛋白是肌苷單磷酸脫氫酶(IMPDH)、GMP合成酶、葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶(G6PD)和檸檬酸合成酶(CS)。這些蛋白都在各種代謝過程中起著重要作用。例如，IMPDH和GMP合成酶是合成鳥嘌呤核苷酸的關(guān)鍵酶，被認(rèn)為是很好的治療靶點；同樣，G6PD和線粒體CS在糖酵解和碳水化合物代謝中起作用。這四種HUB蛋白的qPCR驗證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)一致(圖8)。Pys品系的G6PD和GMP表達水平低于PRU品系，IMPDH和CS表達水平高于PRU品系。

圖7

圖8