特级毛片在线大全免费播放_久久精品www人人爽人人_亚洲欧美日韩国产综合久_国产在线精品一区二区网站免费_成人性生生活性生交

中文標(biāo)題：lPRMT1介導(dǎo)的UBAP2L精氨酸甲基化調(diào)控應(yīng)激顆粒組裝

發(fā)表期刊：Cell Death & Differentiation

影響因子：12.067

發(fā)表時間：2020年

合作單位：南方醫(yī)科大學(xué)

運用技術(shù)：LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

應(yīng)激顆粒(SG)是真核細(xì)胞遇到環(huán)境脅迫時形成的停滯信使核糖核蛋白復(fù)合體(MRNP)的離散集合。RNA結(jié)合蛋白(RBP)通過招募mRNP群體來調(diào)節(jié)它們的凝聚。然而，有關(guān)泛素相關(guān)蛋白2樣蛋白(UBAP2L)在SG動態(tài)調(diào)控中的細(xì)胞和分子機制仍不清楚。

● 研究結(jié)果

1. UBAP2L參與SG組裝

研究者將FLAG-UBAP2L或FLAG空載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用FLAG一抗進行Co-IP。質(zhì)譜法分析FLAG-UBAP2L組和FLAG組之間的差異條帶。其中3個沉淀蛋白被鑒定為脆性X智力低下綜合征相關(guān)蛋白2(FXR2)、FXR1和ras GTPase激活蛋白結(jié)合蛋白2(G3BP2)(圖1A)?；プ鲗嶒灡砻鱑BAP2L與FXR1、FXR2和G3BP2相互作用（圖1B-D）。由于FXR1、FXR2和G3BP2參與了SG的形成，研究者進一步調(diào)查了UBAP2L是否也參與了這一細(xì)胞過程。用5種不同的SG誘導(dǎo)劑刺激HeLa細(xì)胞，對UBAP2L及其結(jié)合伙伴G3BP或FXR1進行聯(lián)合IF分析，以確定UBAP2L在不同應(yīng)激條件下參與SG的情況。結(jié)果表明UBAP2L不參與克霉唑（CZ）誘導(dǎo)的SG(圖1E)。在HeLa細(xì)胞中UBAP2L和FXR1的Co-IF分析中也得到了類似的結(jié)果(圖1F)。這些結(jié)果表明，UBAP2L參與了多種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的SG的形成。

圖1

2. UBAP2L調(diào)節(jié)SG動態(tài)

通過G3BP和eIF4G(另一個典型的SG成分)作為標(biāo)記(圖2A、C和E)，敲除UBAP2L后，AS、H2O2和山梨醇誘導(dǎo)的SG的形成顯著減少。此外，在UBAP2L基因敲除后，去除AS后SG的檢測率略高于應(yīng)激組，這表明UBAP2L基因敲除延緩了SG的降解。這些結(jié)果表明，UBAP2L基因敲除不僅抑制了應(yīng)激誘導(dǎo)的SG組裝，而且延緩了應(yīng)力消除后SG的拆解。UBAP2L過表達促進了H2O2誘導(dǎo)的SG組裝，NC組和RNAi組在去除H2O2后SG的形成都顯示出2倍以上的增加(圖2B，D和E)。這些結(jié)果表明，UBAP2L是SG動力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，是SG組裝和拆卸所必需的。

圖2

3. UBAP2L對SG核仁與40S核糖體亞基相互作用的影響

接下來，研究者探究了UBAP2L介導(dǎo)SG組裝的機制。WB分析顯示，無論在有無應(yīng)激刺激的情況下，UBAP2L蛋白水平都保持相對穩(wěn)定(圖3A)。此外，UBAP2L敲除(圖3B)或過表達(圖3C)都并沒有改變其他SG蛋白的蛋白質(zhì)水平。這表明UBAP2L介導(dǎo)的SG動態(tài)調(diào)控不涉及UBAP2L本身或其他SG蛋白表達的變化。因此，研究者探究了UBAP2L影響SG核蛋白或40S核糖體亞基[例如核糖體蛋白(RP)S6]之間的相互作用。結(jié)果顯示，在正常和AS條件下，UBAP2L基因敲除抑制了G3BP2與PABPC1或RPS6之間的相互作用（圖3D）。加入RNaseA后，G3BP2與PABPC1的結(jié)合減弱，而與RPS6的結(jié)合增強，UBAP2L基因敲除后G3BP2與PABPC1的結(jié)合也減弱。這些結(jié)果表明，UBAP2L影響SG核仁與40S核糖體亞基之間的相互作用，提示著UBAP2L調(diào)控SG動態(tài)的機制。

圖3

4. SG組裝需要UBAP2L中的RGG基序

UBAP2L包含一個UBA結(jié)構(gòu)域，一個RGG基序，三個具有預(yù)測mRNA結(jié)合活性的區(qū)域，以及一個未知功能域。這些特征賦予了UBAP2L成核SG形成的能力。因此，我們檢測到UBAP2L與其他已知的SG核蛋白或核糖體亞基的潛在聯(lián)系。結(jié)果顯示，UBAP2L在正常條件下與G3BP1、G3BP2和PABPC1結(jié)合，這些相互作用在AS處理后略有下降。UBAP2L與核酸體的結(jié)合是RNA依賴性的，因為它們的結(jié)合在RNase處理后完全消失，而它對核糖體解離的EDTA-EGTA(EE)或穩(wěn)定核糖體的Mg2+具有抗性。正常情況下，UBAP2L與小的40S亞基蛋白RPS6結(jié)合，而不與大的60S亞基RPL4結(jié)合，表明UBAP2L優(yōu)先與40S亞基結(jié)合，而不是60S核糖體亞基。UBAP2L直接與EE解離的40S和60S亞基中的RPS結(jié)合，而在Mg2+穩(wěn)定的完整80S核糖體中不能與RPS結(jié)合，但不與亞基中的rRNA結(jié)合。為了進一步定位UBAP2L中負(fù)責(zé)這些關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)域，用標(biāo)記的UBAP2L-野生型(WT)或缺失體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，Co-IP/WB分析UBAP2L缺失與SG蛋白的相關(guān)性。結(jié)果表明，RGG基序是UBAP2L通過招募其他核因子和核糖體亞基形成SG所普遍需要的，而DUF結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了UBAP2L和G3BP之間的分子相互作用，從而協(xié)同促進了SG的成核。接下來，研究者探究了每個結(jié)構(gòu)域在具有穩(wěn)定UBAP2L下調(diào)的HeLa細(xì)胞中SG凝聚中的作用。結(jié)果表明，在正常條件下，UBAP2L-WT的瞬時過表達誘導(dǎo)了SG的形成，這表明UBAP2L的過表達導(dǎo)致了SG的成核。UBAP2L RGG在正常情況下顯示出散在的胞漿定位，并在AS處理后完全排除在G3BP2組裝之外(圖4C，D)，這證實了RGG基序在UBAP2L SG能力中的重要作用。DUF結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致UBAP2L從細(xì)胞質(zhì)穿梭到細(xì)胞核(圖4C)，表明去除DUF結(jié)構(gòu)域增加了核UBAP2L水平，降低了UBAP2L細(xì)胞質(zhì)表達。研究者還觀察到G3BP1/2的適度胞質(zhì)-細(xì)胞核易位(圖4E)。然而，在G3BP1/2雙敲除后沒有觀察到這種UBAP2L核轉(zhuǎn)位(圖4F)，UBAP2L基因敲除也未能誘導(dǎo)G3BP移位到細(xì)胞核中(圖2A)，表明UBAP2L表達并不負(fù)責(zé)將G3BP保留在細(xì)胞質(zhì)中，而DUF結(jié)構(gòu)域充當(dāng)了這一角色。

圖4

5. UBAP2L中的RGG基序被PRMT1不對稱地甲基化

Co-IP/MS分析還確定了UBAP2L的另一個相互作用伙伴，PRMT1(圖5A，B)。體外甲基化試驗表明，UBAP2L被PRMT1二甲基化(圖5C)。RGG結(jié)構(gòu)域的缺失取消了UBAP2L與PRMT1的相互作用以及ADMA信號，而UBA結(jié)構(gòu)域的刪除顯著地加強了他們之間的聯(lián)系(圖5D)。這些結(jié)果表明，UBAP2L中的RGG基序是PRMT1的獨特靶區(qū)。為了證實RGG基序中的精氨酸殘基被PRMT1甲基化，研究者特別設(shè)計了UBAP2L結(jié)構(gòu)，其中RGG基序中的所有精氨酸殘基都突變?yōu)楸彼?UBAP2L-R131-190A)或賴氨酸(UBAP2L-R131-190K)，丙氨酸取代被用來測試精氨酸殘基的生物學(xué)作用，而賴氨酸取代被用來測試不對稱二甲基官能團的作用。結(jié)果表明，PRMT1只針對UBAP2LWT，而不是UBAP2L-R131-190A或UBAP2L-R131-190K突變體(圖5e)，AS處理降低了UBAP2L-WT與PRMT1的相互作用，以及ADMA水平(圖5e)，表明脅迫降低了UBAP2L甲基化。接下來研究者評估了精氨酸甲基化和SG形成之間的關(guān)系，UBAP2L-R131-190K與UBAP2L-WT的SG能力相當(dāng)，而UBAP2L-R131-190A則顯示出明顯的SG缺乏(圖5F，G)。然而，在正?；蛎{迫條件下，SG的形成都沒有明顯的變化(圖5H和I)，仍然檢測到PRMT1結(jié)合和ADMA信號(圖5J)。這些數(shù)據(jù)表明，UBAP2L中的RGG基序被PRMT1不對稱地甲基化。

圖5

6. UBAP2L中精氨酸甲基化減少促進SG組裝

基于以上結(jié)果，研究者推測UBAP2L中精氨酸甲基化水平的降低促進了SG的組裝?；蚯贸龑嶒烇@示，PRMT1敲除顯著促進了UBAP2L-WT誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞中SG的形成，而PRMT1過表達則顯著抑制了SG的形成。在用PAN甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑腺苷二醛(ADOx)處理的細(xì)胞中，UBAP2L-WT組，而不是UBAP2L-R131-190K組，顯示出比對照組明顯更多的SG(圖6A，B)。這表明UBAP2L精氨酸甲基化抑制了SG的組裝，而它的減少促進了SG的組裝。最后，研究者進行了應(yīng)激恢復(fù)實驗，以監(jiān)測UBAP2L在整個治療和恢復(fù)期的甲基化狀態(tài)。隨著壓力增加，eIF2α磷酸化增加，隨后在恢復(fù)后隨時間降解(圖6D)，UBAP2L上的PRMT1結(jié)合和ADMA水平也均隨著治療降低。在恢復(fù)期間，UBAP2L由PRMT1逐漸與ADMA甲基化(圖6D)。這表明，應(yīng)激降低了UBAP2L甲基化，在應(yīng)激恢復(fù)過程中，UBAP2L甲基化再次增加。這些結(jié)果表明，PRMT1是一個重要的分子開關(guān)，通過監(jiān)測UBAP2L精氨酸甲基化在SG的動態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

圖6