中文標(biāo)題：lncRNA LAMP5-AS1調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞干性

發(fā)表期刊：Journal of Hematology & Oncology

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：23.168

發(fā)表時(shí)間：2020年

合作單位：中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

運(yùn)用技術(shù)：LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

混合系白血病(MLL)基因重排引發(fā)造血干/祖細(xì)胞異常的表觀遺傳修飾和基因表達(dá)，使其成為最具侵襲性的白血病亞型之一。MLL基因可以與60多個(gè)伙伴重組，直接抑制MLL重排本身顯然是困難的。因此，了解MLL白血病細(xì)胞如何促進(jìn)自我更新和阻滯分化的機(jī)制才能提供新的治療策略。

● 研究結(jié)果

1. LAMP5-AS1是維持抗MLL白血病細(xì)胞分化的自我更新能力所必需的

LAMP5-AS1是起源于20號(hào)染色體上溶酶體相關(guān)膜蛋白5(LAMP5)編碼基因反義鏈上的lncRNA。研究者在大量臨床樣本的分析中發(fā)現(xiàn)了LAMP5-AS1在MLL白血病中的高表達(dá)(圖1A）。取4例MLL白血病患者骨髓進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，其中包括3例急性淋巴細(xì)胞白血病和1例急性髓系白血病。LAMP5-AS1基因敲除后，原代細(xì)胞被顯著誘導(dǎo)向淋巴細(xì)胞或單核/巨噬細(xì)胞分化(圖1B），集落形成能力顯著減弱(圖1C），白血病干細(xì)胞和祖細(xì)胞的分化水平增加(圖1D)，細(xì)胞的增殖和自我更新能力嚴(yán)重受損(圖1E)，分化急劇增加(圖1F)。這些結(jié)果表明，敲除LAMP5-AS1基因可顯著抑制MLL白血病細(xì)胞的自我更新能力，促進(jìn)其分化，提示著LAMP5-AS1基因在MLL白血病的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。

圖1

2. LAMP5-AS1促進(jìn)MLL白血病進(jìn)展

接著，研究者將轉(zhuǎn)染shLAMP5-AS1的MOLM13細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞(sh-NC)注射到NOD/SCID小鼠尾靜脈，建立了異種移植模型，進(jìn)一步探究LAMP5-AS1在體內(nèi)對(duì)MLL白血病發(fā)生過程的影響。H&E染色檢測(cè)LAMP5-AS1基因敲除對(duì)小鼠臟器浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，與sh-NC組小鼠相比，轉(zhuǎn)染sh-LAMP5-AS1的小鼠骨髓、脾臟和肝臟中的MLL白血病細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖2A)，器官浸潤(rùn)能力顯著降低(圖2B，C)，分化標(biāo)記CD11b、CD14(圖2D，E)和顯著的分葉狀核型顯著增加(圖2F)，小鼠存活時(shí)間更長(zhǎng)(圖2G)，MOLM13細(xì)胞的自我更新頻率顯著降低(圖2H）。這些結(jié)果表明，LAMP5-AS1是一種在MLL白血病中特異性高表達(dá)的lncRNA，對(duì)MLL白血病促進(jìn)自我更新能力和抑制分化是必需的。

圖2

3. LAMP5-AS1與H3K79甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L在其催化區(qū)富含賴氨酸的區(qū)域直接結(jié)合

研究者通過RNA pull-down和質(zhì)譜分析鑒定與LAMP5-AS1相互作用的蛋白質(zhì)，其中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L引起了研究者的興趣，DOT1L被MLL融合蛋白招募，導(dǎo)致HOXA基因、MEIS1基因和其他基因的表觀激活，在MLL白血病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。為了驗(yàn)證LAMP5-AS1可能通過與DOT1L相互作用而發(fā)揮作用的這一假設(shè)，研究者先后通過RNA pull-down和RIP實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證了二者之間的相互作用和這種相互作用的特異性（圖3A，B）。為了進(jìn)一步探究LAMP5-AS1是如何與DOT1L結(jié)合的，以及它是否有可能影響組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的功能，研究者接下來用DOT1L或LAMP5-AS1截?cái)嗟耐蛔凅w進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。最終結(jié)果表明，LAMP5-AS1與DOT1L催化結(jié)構(gòu)域的390-407aa區(qū)域（一個(gè)富含賴氨酸的區(qū)域，對(duì)于DOT1L(1-416aa)催化H3K79甲基化非常重要）特異性結(jié)合(圖3D-I)。

圖3

4. LAMP5-AS1對(duì)DOT1L甲基轉(zhuǎn)移酶活性的影響

接下來，研究者通過無細(xì)胞組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTase)檢測(cè)了LAMP5-AS1是否通過與其催化結(jié)構(gòu)域的富含賴氨酸區(qū)結(jié)合而影響DOT1L甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。分別通過體外轉(zhuǎn)錄和原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了純化的LAMP5-AS1和重組GST標(biāo)記的1-416aa DOT1L(圖4A，b)，從HeLa細(xì)胞中分離的核小體，以及S-腺苷蛋氨酸用于HMTase分析(圖4C)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DOT1L-LAMP5-AS1復(fù)合物具有更高的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，且lncRNA具有刺激高階H3K79甲基化的能力(圖4D)。進(jìn)一步進(jìn)行電泳遷移率改變分析(EMSA)，鑒定出了LAMP5-AS1(503-764nt)和DOT1L(1-416aa)之間的直接相互作用(圖4E)。這些結(jié)果表明，LAMP5-AS1通過增強(qiáng)DOT1L的甲基轉(zhuǎn)移酶活性來促進(jìn)MLL白血病細(xì)胞的自我更新能力。

圖4

5. LAMP5-AS1調(diào)控MLL融合蛋白靶基因H3K79me2/3的全局模式   

鑒于LAMP5-AS1通過直接與N端催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合而促進(jìn)DOT1L的甲基轉(zhuǎn)移酶活性這一特點(diǎn)，研究者進(jìn)行了一系列后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究LAMP5-AS1是否能影響H3K79me2/3的全基因組水平。Western blotting分析顯示，敲除LAMP5-AS1導(dǎo)致MOLM13細(xì)胞和原代MLL白血病細(xì)胞中H3K79me2和H3K79me3的水平顯著降低(圖5A，B)，這表明LAMP5-AS1可能是H3K79甲基化狀態(tài)較高的關(guān)鍵因素。ChIP分析證實(shí)了在LAMP5-AS1被沉默后，HOXA9、HOXA10和Meis1基因體上H3K79me2/3的下調(diào)(圖5D-F）。研究者還進(jìn)行了129個(gè)MLL-AF9靶基因的薈萃分析(圖5G)，和MLL融合蛋白核心靶基因的表達(dá)模式（圖5H），最終結(jié)果表明，LAMP5-AS1通過上調(diào)H3K79me2/ME3和DOT1L異位靶基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)MLL白血病細(xì)胞自我更新和阻滯分化。

圖5

6. LAMP5-AS1可作為MLL白血病不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因子  

最后，為評(píng)估LAMP5-AS1的臨床相關(guān)性，研究者重新分析了419例患者樣本，結(jié)果顯示LAMP5-AS1在這些組之間存在差異表達(dá)，且在MLL白血病中的表達(dá)水平最高(圖6A)，進(jìn)一步檢測(cè)了7例配對(duì)MLL白血病患者，結(jié)果顯示與MLL融合蛋白水平呈顯著正相關(guān)的LAMP5-AS1在CR樣本中的表達(dá)與初步診斷樣本相比顯著降低(圖6B)。這些結(jié)果提示LAMP5-AS1的特異性上調(diào)可能是MLL白血病的一個(gè)有用的生物標(biāo)志物。隨后，ROC曲線分析和生存率分析也證明，LAMP5-AS1的高表達(dá)與MLL白血病患者的預(yù)后不良密切相關(guān)，表明該lncRNA可作為MLL白血病未來診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物（圖6C，D）。

圖6

結(jié)論：

研究結(jié)果表明，lncRNA LAMP5-AS1在MLL白血病細(xì)胞的自我更新過程和分化阻滯中起著重要的作用。LAMP5-AS1對(duì)維持DOT1L在MLL白血病中的高酶活性具有重要意義，可能成為治療MLL白血病的一個(gè)有價(jià)值的靶點(diǎn)。

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