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中文標(biāo)題：Circ-FBXW7在抑制膠質(zhì)瘤發(fā)生中的新作用

發(fā)表期刊：JNCI J Natl Cancer Inst

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：11.816

發(fā)表時(shí)間：2018年3月

合作單位：中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院

運(yùn)用技術(shù)：LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看詳情）

● 研究背景

環(huán)狀RNA(CircRNA)是廣泛存在于真核生物基因組中的RNA轉(zhuǎn)錄本。據(jù)報(bào)道，CircRNA在組織發(fā)育、基因調(diào)控和癌癥發(fā)生中都起著重要作用，是近來的一大研究熱點(diǎn)。然而，對(duì)于CircRNA是否編碼功能蛋白還有待進(jìn)一步探究。

● 研究結(jié)果

1. CircRNA在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及癌旁正常組織中的不同表達(dá)模式

為了建立CircRNA圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，研究者對(duì)來自臨床膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織及其配對(duì)的正常組織的核糖體RNA缺失的總RNA進(jìn)行了RNA-seq分析，共鑒定出31145個(gè)CircRNA(圖1A)，使用RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，這些CircRNA大多來自蛋白質(zhì)編碼的外顯子，其他的與內(nèi)含子、5’-UTR、3’-UTR或反義序列比對(duì)(圖1B)。這些已鑒定的CircRNA大多數(shù)小于1500個(gè)核苷酸(圖1C)，且在癌組和正常組的染色體分布無明顯差異，而癌組中的CircRNA總表達(dá)下調(diào)(圖1D，E)。癌組和腫瘤組具有不同的CircRNA表達(dá)模式(圖1F）。研究者將癌癥組和正常組之間差異最大的候選基因與circRNADb進(jìn)行匹配，在這些特定的候選基因中，由FBXW7基因外顯子3和外顯子4環(huán)化而成的新基因Circ_022705引起了研究者的注意(圖2A)。

圖1

2. 環(huán)狀RNA Circ-FBXW7的鑒定

為了驗(yàn)證FBXW7基因的外顯子3和4是否形成了內(nèi)源性CircRNA，研究者設(shè)計(jì)了聚合和發(fā)散引物，專門擴(kuò)增FBXW7的規(guī)范形式或后剪接形式(圖2B)。Circ-FBXW7基因不能被RNase-R酶切，這些不同的引物不能在基因組DNA中擴(kuò)增出任何產(chǎn)物，表明這一結(jié)果不是由于PCR產(chǎn)物或基因組重排造成的。研究者用跨越結(jié)引物驗(yàn)證了RNA-Seq數(shù)據(jù)，qPCR檢測(cè)了100例膠質(zhì)瘤標(biāo)本和100例正常腦組織中Circ-FBXW7的表達(dá)。在膠質(zhì)瘤中，F(xiàn)BXW7的表達(dá)低于正常腦組織(圖2C)。桑格測(cè)序發(fā)現(xiàn)，反向剪接形成了620nt的Circ-FBXW7，推測(cè)可能是由于內(nèi)含子序列的剪切所致。在Northern blotting中，使用連接特異性探針進(jìn)一步檢測(cè)到內(nèi)源CircFBXW7(圖2E)。為了證明Circ-FBXW7的細(xì)胞定位，研究者進(jìn)行了FISH分析，結(jié)果顯示胞漿中有豐富的Circ-FBXW7表達(dá)。當(dāng)轉(zhuǎn)染SiRNA時(shí)，Circ-FBXW7的表達(dá)被抑制(圖2F)。對(duì)不同細(xì)胞組分的qPCR分析也進(jìn)一步證實(shí)，Circ-FBXW7主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖2F)。

圖2

3. Circ-FBXW7編碼能力的評(píng)估

研究者分析了Circ-FBXW7的開放閱讀框(ORF)，發(fā)現(xiàn)在Circ-FBXW7中有一個(gè)潛在的跨越連接ORF，編碼185個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖3A)。為了測(cè)試Circ-FBXW7中可能的IRES活性，研究者使用雙酶載體系統(tǒng)在Rluc和Luc報(bào)告基因之間克隆了全長(zhǎng)或截短的FBXW7 IRES序列。熒光素酶分析表明，與截短或突變的IRES相比，全長(zhǎng)Circ-FBXW7 IRES誘導(dǎo)的LUC/Rluc活性最高，相反，空載體不能誘導(dǎo)LUC激活(圖3B)。這些結(jié)果表明，Circ-FBXW7 IRES可以誘導(dǎo)50個(gè)上限的獨(dú)立翻譯。接下來，研究者建立了一組載體來證實(shí)Circ-FBXW7在人類細(xì)胞中是可翻譯的。結(jié)果顯示，F(xiàn)LAG標(biāo)簽抗體在Circ-FBXW7-FLAG和FBXW7-FLAG轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中僅檢測(cè)到約22 kDa的蛋白，表明Circ-FBXW7-FLAG載體已被翻譯（圖3C）。接下來，研究者用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜在Circ-FBXW7-293T細(xì)胞中分析了FBXW7-185aa的氨基酸序列。由于FBXW7185aa是由“跨越連接ORF”形成的，在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特氨基酸進(jìn)一步表明這個(gè)新的蛋白質(zhì)是由Circ-FBXW7編碼的(圖3C，D)。

圖3

4. FBXW7-185aa對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制

為了排除Circ-FBXW7而不是FBXW7-185aa誘導(dǎo)生物學(xué)功能的可能性，研究者使用圖3C中描述的線性FBXW7-FLAG載體建立了穩(wěn)定高表達(dá)U251和U373的FBXW7-185aa細(xì)胞。通過使用Circ-FBXW7連接引物，我們發(fā)現(xiàn)Circ-FBXW7和Circ-FBXW7-IRES兩個(gè)mut載體都成功地過表達(dá)(圖4A)。此外，只有Circ-FBXW7和FBXW7-FLAG載體的過表達(dá)才能上調(diào)FBXW7-185aa的表達(dá)(圖4B)。接下來，研究者檢測(cè)了這些細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖率。Circ-FBXW7和FBXW7-FLAG穩(wěn)定過表達(dá)的U251和U373細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，表現(xiàn)出大量的G1期阻滯(圖4C)，存活率也大大降低降低(圖4D，E)。用特異性shRNA敲除Circ-FBXW7可降低FBXW7-185aa的表達(dá)(圖4F)，并加速細(xì)胞周期，提高細(xì)胞存活率(圖4G-I)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)BXW7-185aa（而不是Circ-FBXW7）能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖。

圖4

FBXW7α是FBXW7基因中含量最豐富的亞型，是一種定義明確的E3連接酶，可以針對(duì)c-Myc進(jìn)行泛素化誘導(dǎo)的降解。研究者發(fā)現(xiàn)在Circ-FBXW7-和FBXW7-185aa過表達(dá)的細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)都降低(圖5A)。鑒于上述證據(jù)，研究者推測(cè)FBXW7-185aa可能也有助于c-Myc蛋白的穩(wěn)定。半衰期試驗(yàn)證實(shí)，與陰性對(duì)照相比，F(xiàn)BXW7-185aa對(duì)c-Myc具有去穩(wěn)定化作用。此外，F(xiàn)BXW7-185aa比FBXW7α更穩(wěn)定(圖5B)。據(jù)報(bào)道，去泛素化酶USP28通過與FBXW7αN端的相互作用與c-Myc結(jié)合，從而穩(wěn)定c-Myc。研究者推測(cè)FBXW7185aa可能通過USP28破壞c-Myc的穩(wěn)定性，Pull-down實(shí)驗(yàn)和CoIP實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)BXW7-185aa在體外和體內(nèi)與USP28相互作用(圖5C，D)。與FBXW7α相比，F(xiàn)BXW7-185aa與USP28具有更高的結(jié)合親和力，增加FBXW7-185aa可以競(jìng)爭(zhēng)性地將FBXW7α從癌細(xì)胞中的USP28中釋放出來(圖5E)。體內(nèi)和體外泛素化實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)BXW7185aa過表達(dá)可拮抗USP28誘導(dǎo)的c-Myc去泛素化，增加c-Myc泛素化。然而，僅憑FBXW7-185aa并不能泛化c-Myc(圖5F)。在Hs683和SW1783細(xì)胞中，F(xiàn)BXW7-185aa的過表達(dá)不能抑制c-Myc的表達(dá)，表明FBXW7-185aa通過FBXW7a調(diào)節(jié)c-Myc。此外，過表達(dá)USP28抑制了FBXW7-185aa誘導(dǎo)的c-Myc翻轉(zhuǎn)(圖5G)。以上證據(jù)共同闡明了FBXW7-185aa與USP28競(jìng)爭(zhēng)性相互作用并“釋放”FBXW7α降解c-Myc。

圖5

5. Circ-FBXW7和FBXW-185aa的臨床意義

為了探索FBXW7-185aa潛在的臨床意義，研究者檢測(cè)了FBXW7-185aa在幾個(gè)已建立的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。NHA和293T細(xì)胞FBXW7-185aa表達(dá)較強(qiáng)；SW1783和Hs683Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中FBXW7-185aa表達(dá)降低；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和U373中FBXW7-185aa的表達(dá)水平最低。與腫瘤旁組織相比，在隨機(jī)選擇的6個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者樣本中FBXW7-185aa和Circ-FBXW7的表達(dá)相對(duì)降低(圖6A)。接下來，研究者檢測(cè)了38對(duì)來源于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的癌組織和癌旁組織中Circ-FBXW7的表達(dá)，結(jié)果顯示在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中，F(xiàn)BXW7的表達(dá)低于癌旁組織，同時(shí)Circ-FBXW7高表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者比低表達(dá)Circ-FBXW7的患者總生存期更長(zhǎng)(圖6B)。由于常見的FBXW7α突變不影響Circ-FBXW7或FBXW7-185aa，研究者推測(cè)Circ-FBXW7和FBXW7-185aa是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)記物。Circ-FBXW7穩(wěn)定過表達(dá)的U251和U373細(xì)胞顯示出比對(duì)照細(xì)胞低得多的致瘤性(圖6C)，此外，穩(wěn)定過表達(dá)U251和U373細(xì)胞的Circ-FBXW7小鼠比對(duì)照組的壽命更長(zhǎng)(圖6D)。

圖6

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