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調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄后命運(yùn)的真核 RNA 分子的兩個(gè)特征是 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和 RNA 結(jié)合蛋白 (RBP) 相互作用位點(diǎn)。然而，從未獲得對(duì)紅細(xì)胞生成過程中這些序列特征的動(dòng)態(tài)性質(zhì)的全面全局概述。在這里，我們使用我們的核糖核酸酶介導(dǎo)的結(jié)構(gòu)和 RBP 結(jié)合位點(diǎn)映射方法來揭示 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和 RBP-RNA 相互作用位點(diǎn)的全球景觀，以及在這一重要發(fā)展過程中這些特征的動(dòng)態(tài)。我們?cè)谡麄€(gè)過程中確定了 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和 RBP 結(jié)合的動(dòng)態(tài)模式，并確定了一組相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合序列基序及其動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)和 RBP 結(jié)合背景。最后，使用這些動(dòng)態(tài)結(jié)合序列，我們確定了許多在哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞生成過程中在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中具有已知和假定關(guān)鍵功能的 RBP。總的來說，這項(xiàng)全球分析揭示了哺乳動(dòng)物血細(xì)胞發(fā)育的新轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑。

在真核系統(tǒng)中，RNA 結(jié)合蛋白 (RBP) 從合成到衰變與 RNA 相互作用，從而增加了轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性。最近的一項(xiàng)完整的 mRNA RBPome 研究在 HeLa 細(xì)胞中鑒定了數(shù)百個(gè) RBP，這些 RBP 能夠在確定 RNA 功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。 這些功能包括一系列轉(zhuǎn)錄后過程，包括剪接、聚腺苷酸化、核輸出、定位、運(yùn)輸、翻譯和降解。

已顯示 RBP 以序列和 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)特異性方式與其結(jié)合靶標(biāo)相互作用。 在過去十年中出現(xiàn)了幾種高通量方法來解決 RNA 結(jié)合蛋白、它們的目標(biāo)和 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的相互作用。 這些技術(shù)通常使用化學(xué)探針或結(jié)構(gòu)特異性 RNases（單鏈 RNases (ssRNases) 和雙鏈 RNases [dsRNases]）來提供單鏈或雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域的位點(diǎn)特異性證據(jù) 。

迄今為止，已知的 RBP-RNA 相互作用位點(diǎn)庫是建立在逐個(gè)蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上的，研究確定了單個(gè)感興趣的蛋白質(zhì)的靶標(biāo)，通常通過使用交聯(lián)和免疫沉淀測(cè)序 (CLIP -seq)。在 CLIP-seq 中，樣品被紫外線照射以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與其 RNA 靶標(biāo)的交聯(lián)。 隨后用抗體進(jìn)行免疫沉淀會(huì)拉下蛋白質(zhì)和結(jié)合的 RNA 片段，然后對(duì)這些片段進(jìn)行測(cè)序并映射回轉(zhuǎn)錄組。 例如，該技術(shù)用于識(shí)別整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中的 PABPC1 結(jié)合位點(diǎn)，并且該研究進(jìn)一步證明了 5' UTR PABPC1 相互作用位點(diǎn)介導(dǎo)了對(duì)結(jié)合目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的翻譯控制。與這種有針對(duì)性的方法相比，我們最近報(bào)道了蛋白質(zhì)相互作用譜測(cè)序 (PIP-seq) 的方法，該方法允許對(duì)感興趣的樣本中的 RBP-RNA 相互作用位點(diǎn)進(jìn)行全局和無偏見的分析。 在 PIP-seq 中，RNA-蛋白質(zhì)相互作用通過甲醛交聯(lián)穩(wěn)定，然后使用蛋白酶、ssRNase 和 dsRNase 處理的組合進(jìn)行詢問。 這種方法創(chuàng)建了一組正交文庫，能夠同時(shí)闡明整個(gè)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄組中的 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)合序列。

對(duì)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞生成的研究表明，該過程涉及基因表達(dá)的一系列復(fù)雜且具有階段特異性的變化。 成熟的紅細(xì)胞來源于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，它們經(jīng)歷了一系列越來越嚴(yán)格的譜系定型事件。 重要的是，這個(gè)過程包括對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程的嚴(yán)重依賴，尤其是在其終端步驟 。 終末紅細(xì)胞生成包括細(xì)胞大小減少、血紅蛋白生成增加、膜重組、染色質(zhì)凝聚，最后是去核。 雖然分化的每個(gè)階段也表現(xiàn)出階段特定的轉(zhuǎn)錄組，但 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和 RBP 結(jié)合位點(diǎn)動(dòng)力學(xué)對(duì)該過程的貢獻(xiàn)以前尚未在全球范圍內(nèi)進(jìn)行過探索。

在這里，通過對(duì)小鼠紅細(xì)胞白血病 (MEL) 細(xì)胞進(jìn)行 PIP-seq，我們確定了 RBP 結(jié)合位點(diǎn)，提供了對(duì) RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的全轉(zhuǎn)錄組觀察，并在紅細(xì)胞的終末階段分析了這些 RNA 特征及其相互作用發(fā)展。  我們的結(jié)果對(duì)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞發(fā)育的終末階段發(fā)生的 RBP 結(jié)合事件和 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生了公正的看法。   此外，這些數(shù)據(jù)集為未來研究結(jié)合 RNA 區(qū)域和 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞分化這一關(guān)鍵過程的功能重要性提供了資源。