基因組革命揭示了疾病相關基因的環(huán)境。 詢問蛋白質的功能更加困難。 測量蛋白質-蛋白質相互作用如何響應細胞的擾動而變化——使用化學物質或調整基因可以揭示對在特定疾病中起作用的蛋白質的見解。

量化蛋白質相互作用

蛋白質不會單獨作用。它們通常與其他蛋白質一起進行切片和切塊并催化反應。了解這種蛋白質-蛋白質相互作用或 PPI，有助于探究一個基因的突變如何影響蛋白質如何相互“交談”以驅動疾病。

科學家通常一次只測量一種蛋白質-蛋白質相互作用。 在一個緩慢而費力的過程中，他們抓住一種蛋白質，將其從細胞中拉出，并繪制出它與哪些蛋白質相互作用的圖譜。 定量親和純化質譜法或 q-AP-MS 等方法可以以更高的通量測量蛋白質網絡在其天然環(huán)境（細胞）內的變化。

在其基本形式中，q-AP-MS 的工作原理如下：細胞（或整個動物）被“喂食”大量氨基酸，隨著時間的推移，這些氨基酸會融入蛋白質中。  平行制備其他細胞作為陰性對照。   然后用編碼待研究蛋白質的基因轉染細胞；  蛋白質通常用標簽進行修飾，例如 GFP，以便以后可以輕松分離。   接下來，蛋白質從細胞中切下并穿過凝膠，凝膠中含有與蛋白質標簽結合的抗體。  蛋白質被切割成更小的片段，一切都通過質譜儀運行。   結果是哪些蛋白質與所選蛋白質結合的定量快照。

然而，在過去幾年中，其他方法彌補了與 q-AP-MS 相關的一些缺點。 一方面，將標簽融合到感興趣的蛋白質上可以從根本上改變蛋白質的行為方式。 該方法還僅提供一個時間點細胞中 PPI 的快照，并且該方法偏向于強相互作用的蛋白質； 瞬態(tài)連接更難檢測和測量。 

解決 PPI 問題

“多年來，AP-MS 實驗依賴于用相對較大的熒光蛋白 GFP 和/或其異源過度表達標記蛋白質，”ChromoTek 高級科學家兼研發(fā)分析團隊負責人 Christian Linke-Winnebeck 說，這是 Proteintech Group 的一部分。   “當然，雖然這種方法已經產生了很多知識，但感興趣的蛋白質可能仍然受到龐大標簽和高于正常表達水平的影響?！?

這就是為什么實驗室現在不使用 GFP 標記，而是使用 CRISPR 直接標記基因組中的基因，以避免干擾基因的表達水平。 3 Linke-Winnebeck 說，其他團體也在使用“分裂熒光蛋白”來標記蛋白質。 在這種情況下，“只有一小部分熒光蛋白與您感興趣的蛋白質融合，其余部分在單獨的質粒上表達，”他說。 “僅使用一個小片段使 CRISPR-Cas 內源性標記方法的工作變得更加容易，”因為使用 CRISPR 插入大基因可能很困難。

在最近的預印本中，一家德國實驗室正是使用這種方法“用熒光蛋白 mNeonGreen 的片段標記人類細胞系中的 1,300 多個內源基因，”Linke-Winnebeck 說，然后分裂開細胞并使蛋白質通過一種含有高親和力抗體片段或納米抗體的特殊凝膠，用于 mNeonGreen，由 ChromoTek 作為 MNeonGreen-Trap 出售。  “這允許在自然環(huán)境中對 1,300 種蛋白質進行可視化和深入分析?！?

為了實時跟蹤 PPI，并收集超出時間快照的數據，科學家們轉向了 q-AP-MS 之外的方法。 一種稱為 BRET（生物發(fā)光共振能量轉移），使用光來檢測相互作用的蛋白質。 一種蛋白質與熒光素酶（其作用類似于電子供體）融合，而另一種蛋白質與熒光蛋白融合，作為受體。 當兩者靠近時，電子從供體轉移到受體，受體發(fā)出熒光。 4 該實驗甚至可以在 384 孔板中平行進行，并且可以在大約兩個小時內測量熒光。

這可以對 PPI 進行實時的動力學分析，從而更透徹地了解 PPI 動態(tài)以及它可能如何不同，例如，在化合物治療之間或相關蛋白質之間的差異

“這些 PPI 方法通常用于篩選工作，以識別調節(jié)目標 PPI 的新化合物，并且可以輕松適應以更好地了解臨床相關突變如何影響細胞 PPI 及其對潛在治療干預的反應，”丹尼爾斯說。  并且“因為這些方法允許在天然細胞環(huán)境中分析蛋白質相互作用動力學，所以它們通常用于確認生化 PPI 研究的結果”——例如 q-AP-MS，它需要從細胞中去除蛋白質—— “反映了細胞內實際發(fā)生的情況?！?

為了測量瞬時或微弱的蛋白質相互作用，科學家可以使用表面等離子體共振或 SPR，這是一種無標記、基于光學的生物物理方法，其中將少量配體固定在表面上，然后是結合伙伴，例如作為蛋白質，通過微流體流動系統(tǒng)引入。 5 當兩者結合時，反射光強度的變化（由于非?？拷鼈鞲衅鞅砻娴恼凵渎首兓┛捎糜跍y量結合在一起的分子的比例。 通過隨時間測量，這些數據用于計算結合親和力和結合/解離動力學。 通過靈敏度、自動化和并行流體的改進，現代 SPR 儀器每天可以例行篩選或表征 100 到 1000 次交互。

這種信息豐富的技術使我們能夠獲得多種類型的信息，包括親和力（相互作用的緊密程度或治療劑與其靶標的結合強度）、動力學（相互作用的速度）、濃度（功能活性產品的數量）

Belcher 說，這項技術對藥物發(fā)現特別有用，因為可以并行篩選大型抗體庫，以了解它們如何與蛋白質結合。  一旦確定了藥物，SPR 還可以用于在成熟過程中精確跟蹤和測量其親和力和/或動力學。

測量 PPI 以促進臨床發(fā)現

這三種方法——q-AP-MS、BRET 和 SPR——一起以令人印象深刻的細節(jié)繪制、測量和剖析 PPI。  他們還在藥物發(fā)現、基礎和臨床研究方面迎來了一場名副其實的革命。

在一項研究中，Scripps Research 的研究人員使用串聯質量標簽（用于更定量和并行化質譜的化學標簽）和 AP-MS 來研究稱為 ATF6 的轉錄因子如何控制內質網并“命令”它減少數量一種淀粉樣蛋白，稱為 ALLC，在細胞內產生。 這一發(fā)現加強了我們對系統(tǒng)性淀粉樣蛋白疾病的理解，例如轉甲狀腺素蛋白相關的淀粉樣蛋白疾病。 

另一項研究使用 AP-MS 一次研究了 7,000 多種蛋白質。 研究人員采用 HEK293T 腎細胞，用 2,594 種不同的“誘餌”轉染它們，并使用質譜法揭示了 7,668 種蛋白質中的 23,744 種相互作用。 7 其他團體進一步擴展了這項工作； 今年早些時候，不列顛哥倫比亞大學的一個團隊在包括心臟和大腦在內的七種不同小鼠組織中繪制了超過 125,000 個 PPI。 大多數相互作用以前沒有報道過。 8 他們使用了一種有點類似于 q-AP-MS 的技術，稱為 蛋白質相關分析 ——哺乳動物的穩(wěn)定同位素標記。

NanoBRET 也已被證明是了解癌癥相關癌基因如何隨著癌癥發(fā)展而調整蛋白質網絡的關鍵。 該技術用于證明與野生型 RAS 蛋白相比，NRAS 突變體與 RAS 效應蛋白 RAF1 顯示出更大的相互作用親和力。 9 研究人員證實，在不分裂開放細胞的情況下，該突變改變了對調節(jié)癌癥很重要的 PPI 網絡。 Daniels 說，該論文“幫助確定了侵襲性癌癥病例背后的分子機制，為更好地預測 RAS 突變的生物學行為提供了又一步?！?

當談到我們這個時代的故事時，COVID-19，SPR 已被證明對于衡量候選藥物與病毒相互作用的結合親和力和動力學至關重要。 例如，去年，Regeneron Pharmaceuticals 發(fā)表了針對 SARS-CoV-2 的兩種抗體（casirivimab 和 imdevimab）的結合動力學 10 ； Belcher 表示，它們是世界衛(wèi)生組織推薦的單克隆療法的一部分。 在該研究中，“Biacore SPR 系統(tǒng)用于確定抗刺突 mAb 與 SARS COV2 刺突蛋白結合的結合動力學和親和力?！?

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