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在最近發(fā)表在Cell Reports上的一項(xiàng)研究中，研究人員證明了成簇的定期散布的短回文重復(fù)序列（CRISPR）介導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞的消除。

原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種侵襲性腫瘤，治療具有挑戰(zhàn)性，盡管采用多種治療方案，其中位生存期為12至15個(gè)月。研究已經(jīng)表明廣泛的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，細(xì)胞亞群表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)模式、突變、表觀遺傳狀態(tài)和拷貝數(shù)畸變，這也使得靶向特定分子過(guò)程的治療無(wú)效。

替莫唑胺（TMZ）是目前治療GBM的一線化療藥物，對(duì)TMZ的敏感性取決于O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）啟動(dòng)子的甲基化。雖然基于TMZ的治療可以提高生存率，副作用較少，但大多數(shù)患者都會(huì)經(jīng)歷疾病進(jìn)展。

TMZ還增加了體細(xì)胞突變率，并與DNA錯(cuò)配修復(fù)（MMR）途徑的丟失和腫瘤基因組不穩(wěn)定性相結(jié)合，導(dǎo)致超突變。目前，對(duì)于高度突變的神經(jīng)膠質(zhì)瘤沒(méi)有有效的治療方法。因此，迫切需要消除GBM細(xì)胞的療法，無(wú)論其突變譜如何。

在本研究中，研究人員引入了基因組/癌癥脫落，這是一種基于CRISPR的治療策略，通過(guò)靶向腫瘤基因組中的獨(dú)特重復(fù)序列來(lái)治療原發(fā)性/復(fù)發(fā)性GBM。首先，他們將患者的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GBM與其天然基因組進(jìn)行了比較?；颊呓邮苁中g(shù)切除，輔助放療和TMZ化療，并在11個(gè)月后復(fù)發(fā)。

腫瘤突變負(fù)荷的定量顯示，原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GBM的突變中位數(shù)分別為123和217個(gè)/兆堿基，均歸類為高突變。在原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GBM中，分別有超過(guò)4400和11600個(gè)蛋白質(zhì)編碼突變和451484和698557個(gè)非編碼基因組突變。

研究人員計(jì)算了患者天然基因組以及原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GBM中可能的化膿性鏈球菌CRISPR相關(guān)9（Cas9）單向?qū)NA（sgRNA）。在該靶空間中可能存在數(shù)億個(gè)sgRNA，稱為“sgRNA-ome”，其中大部分具有多個(gè)靶基因座。研究小組將這些具有重復(fù)靶位點(diǎn)的sgRNA稱為sgCIDE（用于通過(guò)編輯CRISPR誘導(dǎo)的死亡）。

接下來(lái)，他們選擇了前10個(gè)sgCIDE，具有3000至300000個(gè)靶位點(diǎn)，以評(píng)估CRISPR-Cas9通過(guò)靶向重復(fù)序列消除GBM的能力。Cas9和10種sgCIDE在LN-229和U-251 GBM細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)引起穩(wěn)健和快速的細(xì)胞消耗，而表達(dá)非靶向sgRNA的那些細(xì)胞不消耗。

表達(dá)Cas9的細(xì)胞在用sgCIDE轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)顯示出廣泛的基因組片段化。此外，實(shí)時(shí)定量活細(xì)胞成像表明，sgCIDE在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第1天引起生長(zhǎng)抑制，并在第2天引起細(xì)胞死亡。接下來(lái)，研究小組在TMZ敏感和耐藥GBM中測(cè)試了基因組破碎。

將表達(dá)Cas9的TMZ抗性LN-18和T98 G以及TMZ敏感性LN-229和U-251 GBM細(xì)胞用TMZ處理或用含有sgCIDE的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞活力定量顯示TMZ劑量滴定的預(yù)期效應(yīng)，僅在TMZ敏感細(xì)胞中有明顯的致死性。相比之下，sgCIDEs的表達(dá)在所有四種細(xì)胞系中引起病毒滴度依賴性致死性，與MGMT啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)無(wú)關(guān)。

集落形成測(cè)定顯示，相對(duì)于二甲亞砜（DMSO）處理的細(xì)胞，TMZ處理的U-251細(xì)胞中的集落減少一到兩個(gè)對(duì)數(shù)尺度，而用sgCIDE轉(zhuǎn)導(dǎo)觀察到集落減少兩到三個(gè)對(duì)數(shù)尺度。然而，一些sgCIDE轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞存活并形成集落。

建立了這些逃逸克隆的單克隆細(xì)胞系，并開發(fā)了表達(dá)sgRNA和mCherry或編碼sgRNA和mCherry標(biāo)記的Cas9的一體化版本的慢病毒載體。用僅提供新sgRNA的載體再處理逃逸克隆未能引起細(xì)胞耗竭，而用一體化載體再處理導(dǎo)致有效的細(xì)胞消融。

其他研究表明，有效消除細(xì)胞所需的最小DSB數(shù)量對(duì)于完全互補(bǔ)的靶位點(diǎn)為30個(gè)，對(duì)于具有單個(gè)錯(cuò)配的靶位點(diǎn)為70個(gè)。由于基因組粉碎的靶點(diǎn)也存在于正?；蚪M中，研究人員推測(cè)，高度突變的膠質(zhì)瘤中的癌癥特異性突變可能具有獨(dú)特的序列，可以用于癌癥特異性基因組粉碎（癌癥粉碎）。

復(fù)發(fā)性GBM顯示出高度突變GBM的特征性TMZ突變特征（升高的胞嘧啶至胸腺嘧啶轉(zhuǎn)化）。接下來(lái)，研究小組使用復(fù)發(fā)性GBM衍生的細(xì)胞系來(lái)評(píng)估TMZ突變特征是否可以用于特異性靶向和細(xì)胞消融。這種患者來(lái)源的細(xì)胞系（PDCL），命名為SF 11411，具有與其他GBM細(xì)胞系相似的基因組破碎敏感性。

研究人員確定了10種重復(fù)的sgRNA，這些sgRNA對(duì)復(fù)發(fā)性腫瘤是獨(dú)特的。為了驗(yàn)證，該團(tuán)隊(duì)在正常人類星形膠質(zhì)細(xì)胞（NHA）和PDCL SF 11411中進(jìn)行了大規(guī)模CRISPR篩選。CRISPR文庫(kù)包括（約5000個(gè)）在單個(gè)基因座或多個(gè)基因座處靶向非編碼和編碼基因組的指導(dǎo)、sgCIDE、非靶向?qū)φ蘸桶踩蹍⒖肌?/span>

使用下一代測(cè)序來(lái)比較NHA，并且在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第1天和第28天用CRISPR文庫(kù)以單拷貝轉(zhuǎn)導(dǎo)PDCL細(xì)胞。如預(yù)期的，大多數(shù)sgCIDE在兩種細(xì)胞系中耗盡。非靶向?qū)φ赵趦煞N細(xì)胞系中具有中性效應(yīng)，而癌癥特異性重復(fù)sgRNA僅在SF11411中耗盡，但在NHA中富集。

該研究描述了CRISPR介導(dǎo)的基因組/癌癥粉碎治療復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤。癌癥粉碎依賴于靶向重復(fù)的腫瘤特異性基因座，觸發(fā)CRISPR介導(dǎo)的基因組片段化和DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。此外，基因組破碎與TMZ敏感性和GBM細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)無(wú)關(guān)。

大多數(shù)細(xì)胞屈服于最初的DNA損傷，罕見的逃逸者可以有效地重新治療。腫瘤特異性重復(fù)序列的存在使得能夠通過(guò)靶向治療誘導(dǎo)的突變特征來(lái)切割癌癥?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)癌癥特異性療法以治療高度突變的膠質(zhì)瘤和其他高度突變的癌癥提供了潛在的途徑。

科研產(chǎn)品

? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體

? 人cDNA克隆庫(kù)

? 慢病毒表達(dá)載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務(wù)

? 單克隆抗體測(cè)序

? 抗體從頭測(cè)序

? 抗體表達(dá)服務(wù)

? 重組抗體表達(dá)

實(shí)驗(yàn)試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

? Flag 試劑盒