近日，研究人員開發(fā)并表征了一種高度特異性的EpiEditing系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用催化失活的Cas9（dCas9）來實現(xiàn)等位基因特異性脫氧核糖核酸（DNA）甲基化（ASM）。

表觀基因組編輯涉及使用稱為EpiEditor的工具對特定基因組區(qū)域進行精確重編程。EpiEditor通常由諸如dCas 9、DNMT 3A/3L和單向?qū)Ш颂呛怂幔≧NA）（sgRNA）的組分組成。通過將甲基化引入特定基因座，可以調(diào)節(jié)基因表達。

ASM具體指甲基化僅靶向遞送至基因組基因座的一個等位基因。在由顯性突變引起的疾病的情況下，選擇性地甲基化突變等位基因可以用于抑制其表達，同時保留基因的功能。

在本研究中，通過用來自AIO-mCherry載體的sgRNA表達盒替換pMulti-sgRNA-LacZ-DsRed載體骨架的一部分來構建單個sgRNA表達載體。對于在前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）區(qū)域中具有單核苷酸多態(tài)性（SNP）的靶標，選擇PAM上游的20個核苷酸（nt）的基因組序列作為sgRNA結合位點。相比之下，對于在sgRNA種子區(qū)中具有SNP的靶標，使用含有SNP的最近PAM上游的20 nt序列。

使用CRIP 0 R和CCTop評估所選擇的sgRNA的效率和潛在的脫靶效應，使用QGRS Mapper分析sgRNA區(qū)域中的四鏈體DNA形成，而使用Golden Gate Assembly進行sgRNA表達載體的克隆。此外，用dCas 9 - 10 x SunTag、scFv-DNMT 3A/3L和多sgRNA表達載體的混合物進行HEK 293細胞的轉(zhuǎn)染。

在每個質(zhì)粒中包括熒光標記物以促進三陽性細胞的分選。提取基因組DNA，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，并進行文庫制備用于下一代測序（NGS）。此外，還使用Trim Galore！、PEAR、bwameth和MethylDackel。RNA分離和互補DNA（cDNA）合成之后，使用基因特異性引物進行表達分析，并使用兩步聚合酶鏈反應（PCR）產(chǎn)生文庫。確定外顯子中具有SNP的基因的等位基因表達比率。

由于HEK 293細胞易于處理和高轉(zhuǎn)染效率，因此選擇HEK 293細胞用于本研究。為了收集基因組中SNP的數(shù)據(jù)，查閱了公共數(shù)據(jù)庫。DNA甲基化水平的初始估計值從先前研究中產(chǎn)生的MBD 2-下拉測序數(shù)據(jù)獲得。

進行計算機模擬搜索以鑒定位于基因啟動子區(qū)的未甲基化CGI（CpG島）中的SNP?；跐撛赑AM位點附近或有希望的sgRNA的種子區(qū)域內(nèi)的SNP的存在來過濾搜索結果。鑒定了具有合適SNP的十四個靶基因，其中設計了多達三個sgRNA以靶向每個基因等位基因。

基于SgRNA中SNP的位置（包括種子區(qū)、PAM序列的位置2或PAM位置3）對實驗進行分類。PAM區(qū)域中導致鳥嘌呤（G）至Y變化的SNP是優(yōu)選的，其中Y表示半胱氨酸（C）或?；撬幔═），因為這些變化表現(xiàn)出scFv-DNMT 3A/3L-sfGFP、dCas 9 - 10 x SunTag-BFP和sgRNA-DsRed構建體進入HEK 293細胞的最佳區(qū)分。還使用在人類基因組中沒有結合位點的亂序sgRNA進行對照實驗。還測定了ASM對等位基因特異性基因表達比率的影響。選擇在外顯子中具有SNP的基因，并測定等位基因表達比率。

ASM導致ISG 15-Seed 2和MRPL 52-PAM 3基因的等位基因表達比率的顯著變化。研究人員還對使用dCas 9開發(fā)和表征高度特異性的EpiEditing系統(tǒng)以實現(xiàn)ASM感興趣。使用具有降低的非特異性活性的DNMT 3A/3L的改進版本作為催化部分，并通過SunTag系統(tǒng)連接到sgRNA/dCas 9復合物，用于信號放大和二聚化。

靶向sgRNA的種子區(qū)域或dCas 9的PAM區(qū)域內(nèi)的雜合SNP以實現(xiàn)等位基因區(qū)分。靶向DNA甲基化的效率在靶標之間變化，其中大多數(shù)成功的靶標在選定的CpG位點處達到超過50%的平均DNA甲基化。

ASM的成功基于ASM的總體水平和在靶和脫靶等位基因處的DNA甲基化獲得的比率來評估。最成功的ASM實驗將SNP置于PAM區(qū)域中。脫靶等位基因的不需要的DNA甲基化可能由sgRNA/dCas 9復合物的脫靶結合或DNMT 3A/3L的靶向活性引起。

當前研究的研究人員在HEK 293細胞中使用sgRNA/dCas 9復合物成功實現(xiàn)了靶向等位基因特異性DNA甲基化。這種新方法與等位基因特異性甲基化的高特異性、效率和穩(wěn)定性相關，所述等位基因特異性甲基化產(chǎn)生基因表達的等位基因比率的變化。

該研究結果證明了sgRNA/dCas 9復合物用于等位基因特異性表觀基因組編輯的潛力及其在個性化醫(yī)學中的適用性。

科研產(chǎn)品

? 哺乳動物細胞表達載體

? 人cDNA克隆庫

? 慢病毒表達載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務

? 單克隆抗體測序

? 抗體從頭測序

? 抗體表達服務

? 重組抗體表達

實驗試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

? Flag 試劑盒

輝駿實力