用于改進(jìn)質(zhì)譜和定量蛋白質(zhì)組學(xué)SILAC實驗

在過去的幾十年中，定量蛋白質(zhì)組學(xué)一直是生物學(xué)研究中的一個前沿且要求很高的領(lǐng)域。隨著技術(shù)的進(jìn)步，基于 MS（質(zhì)譜）的方法已成為非常有用的工具，它利用碎片化合物的質(zhì)荷比與其離子豐度成比例。 MS 將結(jié)果作為化合物的離子豐度與其質(zhì)荷比的關(guān)系圖提供，隨后提供有關(guān)化合物的性質(zhì)、可能的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的信息。這種化合物可以是任何蛋白質(zhì)、翻譯后修飾、生物活性分子等。蛋白水解肽的 MS 響應(yīng)可能由于其不均勻的物理化學(xué)性質(zhì)（例如疏水性、偶極矩、大小、電荷、質(zhì)量等）而有所不同。因此它成為一種劇烈運動以準(zhǔn)確量化同一 MS 分析中不同測試樣品之間生物分子相對豐度的變化。為了解決這個缺陷，在通用 MS 協(xié)議中引入了一種新的修改，稱為 SILAC（細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記），它允許將氨基酸的穩(wěn)定同位素插入蛋白質(zhì)或肽中。 SILAC 能夠在同一 MS 運行中對來自不同測試樣品的這些分子進(jìn)行相對和可比較的量化，最終最大限度地減少由 MS 儀器在不同運行中造成的樣品注入和離子抑制導(dǎo)致的結(jié)果的錯誤變異性。

SILAC實驗技術(shù)于2002 年首次引入，作為南丹麥大學(xué)實驗生物信息學(xué)中心 (CEBI) 的一種代謝標(biāo)記技術(shù)。準(zhǔn)確地說，在活細(xì)胞的生長培養(yǎng)基中使用了穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的氨基酸，隨后可以對不同實驗條件下的細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行廣泛比較。

SILAC實驗的原則

SILAC 主要基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸（例如含有 13 C 或 15 N 的精氨酸或賴氨酸）在活細(xì)胞培養(yǎng)物中的代謝結(jié)合。有兩種細(xì)胞群被選擇并在兩種不同的培養(yǎng)基中生長；一個群體的“輕培養(yǎng)基”基本上包含含有天然同位素的氨基酸，而另一個群體則用包含穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸的“重培養(yǎng)基”喂養(yǎng)。

SILAC 背后的關(guān)鍵原理是隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加代謝活動增加，隨后氨基酸在蛋白質(zhì)組中的摻入增加。隨著分裂次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)達(dá)到重狀態(tài)，所有蛋白質(zhì)都含有標(biāo)記的氨基酸。雖然，標(biāo)記效率會根據(jù)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)率（蛋白質(zhì)合成與降解）進(jìn)行預(yù)先優(yōu)化。在確保完全標(biāo)記（等于或 > 95% 的標(biāo)記效率）后，可以對細(xì)胞群進(jìn)行操作，然后從等量的標(biāo)記和未標(biāo)記細(xì)胞群中提取總蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)樣品探測到基于胰蛋白酶的消化形成肽。最終，消化的肽可以在 LC-MS/MS 儀器上進(jìn)行分析。結(jié)果的量化基于同位素標(biāo)記肽與未標(biāo)記肽的比率。來自標(biāo)記和未標(biāo)記樣品的信號強度允許進(jìn)行定量比較。

對于進(jìn)行 SILAC 實驗，氨基酸的選擇非常關(guān)鍵。在理想條件下，這些氨基酸應(yīng)該是培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞存活所必需的一種氨基酸，以確保所選氨基酸的唯一來源來自培養(yǎng)基，例如亮氨酸、賴氨酸和蛋氨酸。

如今， 13 C 或 15 N 標(biāo)記的精氨酸和賴氨酸的組合用于重培養(yǎng)基中，因為在下一步蛋白質(zhì)組學(xué)分析中使用的蛋白水解酶胰蛋白酶在賴氨酸和精氨酸殘基的羧基末端特異性切割。因此，SILAC 標(biāo)記與重賴氨酸和精氨酸的組合以及胰蛋白酶消化的組合提供了對蛋白質(zhì)中除 C 端以外的大多數(shù)胰蛋白酶肽的更大程度的定量，最終達(dá)到更高的蛋白質(zhì)組定量效率。

SILAC實驗多重比較水平

SILAC 實驗可以通過兩個或多個比較級別（plex）進(jìn)行。大多數(shù)實驗比較了兩種不同的細(xì)胞條件。然而，隨著精氨酸和賴氨酸三種同位素不同形式的可用性，也可以進(jìn)行三個級別的比較。最近，由于多級比較的廣泛優(yōu)勢，5-plex SILAC 實驗可用于五種同位素不同形式的精氨酸。盡管 5-plex 系統(tǒng)的缺點是影響了蛋白質(zhì)組的量化效率，因為只有含精氨酸的肽才能用它來量化。為了克服這個問題，可以在相同的測試條件下進(jìn)行兩個 3-plex SILAC 標(biāo)記。

SILAC技術(shù)實驗流程-輝駿生物

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SILAC技術(shù)實驗服務(wù)信息-輝駿生物

項目名稱

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結(jié)果交付

實驗周期

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SILAC

已培養(yǎng)7代以上的SILAC標(biāo)記細(xì)胞（同位素培養(yǎng)基由我方提供；如委托我方培養(yǎng)細(xì)胞，額外收費）
樣本信息表

1、標(biāo)記測試結(jié)果
2、蛋白鑒定及定量結(jié)果表
3、肽段鑒定及定量結(jié)果表
4、差異蛋白結(jié)果表
5、生物信息學(xué)分析結(jié)果
6、質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)
7、實驗報告

8-10周

點擊詢價

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SILAC實驗-輝駿生物客戶文獻(xiàn)

1. Gu C.M. et al: Discovery of the Oncogenic Parp1, a Target of bcr-abl and a Potential Therapeutic, in mir-181a/PPFIA1 Signaling Pathway. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 2019，IF= 5.66.
【研究內(nèi)容】：miR-181a在白血病特別是慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）中表達(dá)下調(diào)，并影響疾病發(fā)展、耐藥性和預(yù)后，但其靶基因的分子機制尚不清楚。該文章通過基因芯片，SILAC蛋白組學(xué)等方法聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)PPFIA1是miR-181a的直接靶基因。CoIP-MS等后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)，PARP1會結(jié)合PPFIA1，抑制PPFIA1或PARP1能夠下調(diào)c-KIT水平，抑制CML細(xì)胞生長，并延長小鼠存活期。研究揭示PPFIA1和PARP1或成為潛在的CML治療靶點。
使用技術(shù)：穩(wěn)定同位素標(biāo)記（SILAC）蛋白質(zhì)組學(xué)實驗、silac蛋白組、silac標(biāo)記定量實驗服務(wù)

2. Guo, H.C. et al: Quantitative Proteomic Analysis of BHK-21 Cells Infected with Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype Asia 1. PLoS ONE. 2015，IF=3.569.
【研究內(nèi)容】：研究者通過穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(SILAC)定量研究了亞洲1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21細(xì)胞后宿主細(xì)胞基因表達(dá)的變化，從結(jié)果中選擇6個變化顯著的蛋白（其中VPS28、PKR、EVI5為下調(diào)，LYPLA1、SEC62和DARS為上調(diào)）做進(jìn)一步研究。Western blot、RT-PCR等試驗驗證了這些蛋白在口蹄疫病毒復(fù)制過程中的功能重要性，提示口蹄疫病毒感染可能通過影響細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)，為口蹄疫病毒感染創(chuàng)造更有利的條件。
使用技術(shù)：SILAC蛋白質(zhì)組學(xué)分析、SILAC實驗、silac蛋白組檢測外包

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