蛋白質(zhì)豐度對于免疫沉淀至關(guān)重要

在免疫沉淀 (IP) 過程中，感興趣的蛋白質(zhì) (POI) 被結(jié)合到珠子（如瓊脂糖或磁性瓊脂糖）上的特定抗體或納米抗體拉下，通過洗滌去除未結(jié)合的樣品內(nèi)容物，例如其他蛋白質(zhì)、細胞碎片和脂質(zhì)，而沉淀的蛋白質(zhì)在珠子上富集，對于成功的 IP，POI 的豐度或表達水平至關(guān)重要；  不幸的是，這經(jīng)常被遺忘，如果 POI 表達強烈且豐富，那么 IP 很可能是直截了當?shù)?，沒有任何困難。   但是，如果 POI 以低豐度或表達水平存在，則可能需要優(yōu)化 IP 協(xié)議。

以下是輝駿生物介紹如何成功免疫沉淀低豐度 POI 的一些方法和技巧：

A. 使用具有高親和力的抗體或納米抗體

使用高親和力、低解離常數(shù) K D 納米抗體可有效下拉少量 POI。 這是因為，根據(jù)穩(wěn)態(tài)結(jié)合方程，當 POI 的濃度等于 K D 。 因此，理想情況下，POI 的濃度應(yīng)超過用于 IP 的抗體/納米抗體的 K D ，以結(jié)合盡可能多的 POI 并保持未結(jié)合 POI 的量盡可能低。 如果抗體的親和力太低，解離常數(shù)太高，雖然 POI 存在于細胞裂解物中，但可能不會沉淀，這可能導致 IP 假陰性結(jié)果。

幸運的是，對于許多納米抗體來說，高親和力和高特異性齊頭并進，確保細胞蛋白的低背景，這是低豐度蛋白 IP 的先決條件。

B. 增加 POI 的濃度

如果無法增加 POI 的豐度或表達水平，則可以使用以下提示和技巧增加其在測定中的濃度：

1. 使用更多細胞或組合幾個細胞沉淀來制備細胞裂解物。

2. 不要向細胞裂解液中添加稀釋緩沖液或僅添加少量緩沖液。

注意：仍然建議使用 500 μL 細胞裂解液和 25 μL GFP-Trap 漿液。

注意：可能需要更頻繁和/或更劇烈的清洗，用 20-50 μL 2x SDS 樣品緩沖液洗脫，并嘗試在 SDS-PAGE/WB 上加載盡可能多的洗脫部分。

C. 放大WB中POI的信號

如果洗脫部分中的 POI 量非常低，即使 IP 成功，它也可能不足以進行 WB 檢測。  在這種情況下，建議放大 POI 的 WB 信號。  當多克隆一抗與多克隆二抗組合用于 WB 檢測時，可獲得最高的信號放大。

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