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Q：收到細(xì)胞后，傳代、凍存后復(fù)蘇過幾次都沒什么問題，最近因?qū)嶒?yàn)室孵箱污染，清潔消毒細(xì)胞室后，重新復(fù)蘇，結(jié)果連續(xù)復(fù)蘇6支，細(xì)胞均未貼壁，今晚復(fù)蘇6小時(shí)后觀察有一瓶相對(duì)貼壁細(xì)胞數(shù)較之前復(fù)蘇失敗瓶多，但貼壁細(xì)胞狀態(tài)不好，形態(tài)不佳，透光度亦不好！到底是哪里出了問題呢？

A：首先，復(fù)蘇過程沒有問題，是否是從液氮拿出直接放入溫水，還有培養(yǎng)箱，二氧化碳濃度，培養(yǎng)基、PH值等環(huán)節(jié)。要么加高濃度FBS 15-20%，看看能否幫助貼壁，當(dāng)然也需要考慮血清問題，還有確信拿來的細(xì)胞沒問題。

其次，應(yīng)該懷疑凍存，實(shí)際上復(fù)蘇出問題的可能非常小，因?yàn)椴僮骱唵?，而且死板，下面這些原因需要逐個(gè)排查：

1、凍存的時(shí)候是不是消化的時(shí)間過長，這是一般人所注意不到的，即使書上也不講這個(gè)問題，但我因?yàn)檫@個(gè)問題就兩種肺癌細(xì)胞和一種肝癌細(xì)胞專門做過試驗(yàn)，這個(gè)絕對(duì)是絕大部分人細(xì)胞復(fù)不活的一個(gè)原因。太長的消化時(shí)間會(huì)讓細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)失去貼壁能力，表現(xiàn)為先貼后死，原因是在你復(fù)蘇的時(shí)候細(xì)胞已進(jìn)入凋亡程序，不可逆轉(zhuǎn)的死亡。
2、凍存液好不好，是什么，甘油還是DMSO，質(zhì)量非常重要，否則也會(huì)死亡。
3、凍存液的量加的是不是太多，ATCC推薦是不超過7%，大于5%，太多也不好。
4、在凍存的時(shí)候是不是把DMSO混均勻，這個(gè)有一些影響，但不算太大。
5、凍存是否按部就班，就是所溫度梯度是不是把握嚴(yán)格，很多人容易忘卻這個(gè)事情，因?yàn)檫@個(gè)東西流程長。
6、如果細(xì)胞污染，是否能很快看到。從這個(gè)角度講建議去除離心這步。
7、細(xì)胞在凍存前是否過密。
　　

還有，不贊成孵箱污染這個(gè)概念的，所有在一個(gè)孵箱里的細(xì)胞都污染一個(gè)細(xì)菌的話，這個(gè)細(xì)菌是源于孵箱的，但這不代表孵箱污染，因?yàn)榉跸錈o論你如何處理都有大量的細(xì)菌，問題在操作。細(xì)胞房不換拖鞋，非常臟，別人的細(xì)胞都污染，很多細(xì)胞都污染到絕種，但只污染一次（兩年內(nèi)只有兩瓶），哪次是因?yàn)閯e人動(dòng)了，每次細(xì)胞擺放順序都是記住的。如果懷疑孵箱污染，那說明在養(yǎng)細(xì)胞這方面很差。

每次污染的原因都要盡可能的找，以后就不犯同樣的問題，這個(gè)很重要，不能靠猜，否則就有可能細(xì)胞養(yǎng)絕最后換課題。