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中文標(biāo)題：GYS2/p53負(fù)反饋環(huán)對(duì)HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用

發(fā)表期刊：Cancer Research

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：13.312

發(fā)表時(shí)間：2018年8月

合作單位：中山大學(xué)腫瘤防治中心

運(yùn)用技術(shù)：GST pull down WB，免疫共沉淀（Co-IP）（由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 研究背景

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第五大最流行的惡性腫瘤和第二大與癌癥相關(guān)的死亡原因。它的發(fā)生歸因于代謝物相關(guān)基因調(diào)控改變引起的細(xì)胞代謝重編程，有證據(jù)表明，糖代謝異常是癌癥的突出特征，然而有關(guān)糖原調(diào)節(jié)的異常很少被研究。因此，明確這種異常代謝的機(jī)制或許可以為肝細(xì)胞癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

● 研究結(jié)果

1. 肝細(xì)胞癌中糖原含量降低

研究者通過(guò)PAS染色分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織中的糖原與非腫瘤組織相比明顯減少(圖1A)。對(duì)768例HCC患者組成的樣本進(jìn)行PAS染色，根據(jù)陽(yáng)性染色比例將患者分為高PAS組和低PAS組，Kaplan-Meier分析顯示低PS染色與總體生存情況不良相關(guān)(圖1D)，多變量Cox回歸模型進(jìn)一步顯示糖原含量是HCC總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。這些數(shù)據(jù)表明，肝細(xì)胞癌中糖原合成受到抑制。 

圖1

2. GYS2在肝細(xì)胞癌中降低，并與不良患者預(yù)后相關(guān)                           

8對(duì)肝癌組織的轉(zhuǎn)錄圖譜顯示，涉及糖原合成和代謝的基因被解除了調(diào)控。其中，GYS2在腫瘤組織中顯著下調(diào)(圖2A)。在HCC新鮮組織中，與匹配的非腫瘤組織(圖2B)相比，近3/4的病例中GYS2 mRNA表達(dá)降低；GYS2蛋白水平在全部HCC標(biāo)本中顯著降低，并且與糖原含量呈正相關(guān)(圖2C，D)；在63.0%(481/763)的HCC中，GYS2表達(dá)明顯下調(diào)(圖2E)。GYS2在60.6%(462/763)的HCC組織中低表達(dá)，常見(jiàn)于PAS染色較弱的病例(圖2F)。Kaplan-Meier分析顯示，GYS2缺乏的患者在SYSUCC和癌癥基因組圖譜中的總體存活率都不佳(圖2G)。多變量Cox回歸模型和分層生存分析進(jìn)一步表明GYS2是影響HCC總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。

圖2

3. GYS2缺失促進(jìn)肝癌體內(nèi)外增殖

為了探討GYS2在HCC中的生物學(xué)功能，研究者在HepG2和QGY-7703細(xì)胞中敲除GYS2，在Bel-7402和Bel-7404細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GYS2(圖3A)。細(xì)胞活力在GYS2沉默的細(xì)胞中顯著增加，但在過(guò)表達(dá)GYS2的細(xì)胞中下降(圖3B)。GYS2基因敲除可顯著誘導(dǎo)EDU陽(yáng)性細(xì)胞，而GYS2過(guò)表達(dá)可使EDU陽(yáng)性細(xì)胞減少(圖3C)。GYS2沉默后，細(xì)胞阻滯于S-G2-M期，而過(guò)表達(dá)GYS2則導(dǎo)致更多的細(xì)胞處于G0-G1期(圖3D)。此外，GYS2缺失的細(xì)胞形成了更多的集落，而GYS2的異位表達(dá)削弱了HCC細(xì)胞的增殖(圖3E)。為了在體內(nèi)驗(yàn)證這些效應(yīng)，研究者建立了裸鼠皮下注射細(xì)胞的異種移植模型。與對(duì)照組相比，GYS2沉默的荷瘤細(xì)胞生長(zhǎng)更快，糖原含量更少，Ki-67表達(dá)更高(圖3F)。這些發(fā)現(xiàn)表明，缺乏GYS2極大地促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖3

4. GYS2激活p53信號(hào)通路

為了揭示GYS2介導(dǎo)的肝癌增殖的潛在機(jī)制，研究者在HepG2和QGY-7703細(xì)胞中進(jìn)行了RNA seq分析。結(jié)果顯示，在GYS2缺失的兩種細(xì)胞系中，p53通路都受到了明顯抑制(圖4A)，GYS2的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)p53蛋白水平，導(dǎo)致p53靶基因的調(diào)控，如p21，14-3-3S和cyclin D1(圖4B)。接下來(lái)研究者通過(guò)Co-IP研究了這兩個(gè)蛋白之間的相互作用(圖4C)，又通過(guò)GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GYS2與p53的直接結(jié)合(圖4D和E)。進(jìn)一步確定相互作用的區(qū)域，結(jié)果顯示，p53的1-101aa區(qū)和GYS2的1-500aa區(qū)是GYS2-p53結(jié)合所必需的(圖4F和G)。為了驗(yàn)證GYS2是否通過(guò)p53發(fā)揮抗肝癌作用，研究者進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)?；謴?fù)p53表達(dá)可部分減弱GYS2缺失對(duì)HepG2和QGY-7703細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。這些數(shù)據(jù)表明，GYS2在肝癌細(xì)胞中通過(guò)與p53的相互作用發(fā)揮腫瘤抑制作用。

圖4

5. GYS2通過(guò)與MDM2的競(jìng)爭(zhēng)性相互作用穩(wěn)定p53

為探索GYS2上調(diào)p53的機(jī)制，研究者通過(guò)使用環(huán)己胺處理，發(fā)現(xiàn)GYS2過(guò)表達(dá)顯著延長(zhǎng)了肝癌細(xì)胞中p53蛋白的半衰期(圖5A)。用蛋白酶體抑制劑MG-132預(yù)孵育細(xì)胞，Co-IP結(jié)果顯示，泛素介導(dǎo)的p53蛋白酶體降解被GYS2沉默增強(qiáng)，但被異位GYS2表達(dá)減弱(圖5B）。轉(zhuǎn)染GYS2 siRNA，用MG-132預(yù)孵育后進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)，再次檢測(cè)GYS2對(duì)p53泛素化的影響。結(jié)果顯示MG132可取消GYS2 siRNA誘導(dǎo)的p53降低(圖5C)。E3泛素連接酶MDM2在p53泛素化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，為確定MDM2是否參與了GYS2對(duì)p53的調(diào)控。研究者在MDM2誘導(dǎo)下，再次檢測(cè)了GYS2對(duì)p53泛素化的影響。結(jié)果顯示GYS2部分減弱了MDM2介導(dǎo)的p53泛素化，GYS2 siRNA阻斷了MDM2 siRNA誘導(dǎo)的p53泛素化抑制(圖5D)。用MDM2 siRNA處理細(xì)胞后再敲除GYS2，WB檢測(cè)P53蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示SiRNA對(duì)MDM2的抑制顯著抑制了GYS2 siRNA對(duì)p53的下調(diào)(圖5E)。接下來(lái)，研究者通過(guò)Co-IP法檢測(cè)了GYS2、MDM2和P53細(xì)胞中的相互作用(圖5F)，結(jié)果所示，GYS2、p53和MDM2通過(guò)相互結(jié)合形成了蛋白質(zhì)復(fù)合物。GST pull-down實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了GYS2與MDM2的直接結(jié)合(圖5G)。此外，MDM2和p53之間的相互作用因GYS2的下調(diào)而增強(qiáng)，但因GYS2在HCC細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)而減少(圖5H和I)。這些數(shù)據(jù)表明，GYS2通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與MDM2結(jié)合來(lái)抑制p53泛素化從而穩(wěn)定p53蛋白。

圖5

6. P53通過(guò)依賴p300的負(fù)反饋環(huán)抑制GYS2

鑒于GYS2在p53介導(dǎo)的異常糖原代謝中的作用。qRT-PCR和WB分析檢測(cè)GYS2 在p53過(guò)表達(dá)或沉默的情況下的表達(dá)，結(jié)果顯示，p53的敲除上調(diào)了GYS2的mRNA和蛋白水平(圖6B)。雙熒光素酶分析表明，p53轉(zhuǎn)染降低了GYS2啟動(dòng)子的活性(圖6C)。CHIP分析也證實(shí)了p53與GYS2啟動(dòng)子結(jié)合(圖6D)。p53的轉(zhuǎn)錄后修飾是其轉(zhuǎn)錄功能所必需的，p300介導(dǎo)的p53乙酰化增強(qiáng)了其反式激活靶的DNA結(jié)合能力。轉(zhuǎn)染GYS2后檢測(cè)4個(gè)p53乙酰化賴氨酸位點(diǎn)的表達(dá)，結(jié)果顯示，GYS2過(guò)表達(dá)增加了賴氨酸373/382處的p53乙?；?圖6E)，這一作用被p300的敲除所阻斷(圖6F)。用特異性p300抑制劑C646或p300 siRNA處理細(xì)胞，可以消除p53介導(dǎo)的GYS2下降(圖6G)。研究者進(jìn)一步構(gòu)建了不能被p300乙?；膒53K373A和p53K382A突變，這兩個(gè)p53突變體的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致GYS2 mRNA和蛋白的減少較少(圖6H)，此外，在p53K373A或p53K382A表達(dá)的細(xì)胞中，p53對(duì)GYS2啟動(dòng)子的抑制作用和結(jié)合減弱(圖6I和J)。這些結(jié)果表明，在負(fù)反饋環(huán)中，p53通過(guò)p300介導(dǎo)的乙?；谵D(zhuǎn)錄上抑制GYS2。

圖6

7. HBx-HDAC1復(fù)合物促進(jìn)p53介導(dǎo)的GYS2抑制作用

HBV編碼的關(guān)鍵致癌蛋白HBx在糖原代謝中的作用尚不明確。分別在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HBx，在HepG2.2.15細(xì)胞中敲除HBx，PAS染色顯示糖原含量，結(jié)果顯示HBx過(guò)表達(dá)減少了HCC細(xì)胞中的糖原含量，而HBx的敲除恢復(fù)了這一趨勢(shì)(圖7A)。在HBx陽(yáng)性的病例中，GYS2的低表達(dá)和PAS染色更常見(jiàn)(圖7B)，而在HBx陰性的HepG2和QGY-7703細(xì)胞中，引入HBx下調(diào)了GYS2的表達(dá)(圖7C)。據(jù)報(bào)道，HBx的活性抑制需要招募協(xié)同因子，而組蛋白去乙?；?HDAC)是與HBx相互作用的主要基因抑制因子。研究者用siRNA處理HepG2.2.15和HepG2-HBx細(xì)胞，Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示了HBx、HDAC1和細(xì)胞核內(nèi)乙?；膒53之間的相互作用(圖7D)。在HBx過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，HDAC1或p53的敲除部分減弱了GYS2 mRNA的減少(圖7E)。熒光素酶和CHIP分析表明，HDAC1或p53的敲除降低了HBx與GYS2啟動(dòng)子的結(jié)合(圖7F和G)。這些數(shù)據(jù)表明，HBx與HDAC1共同作用于p53介導(dǎo)的抑制HBV陽(yáng)性肝癌中GYS2的表達(dá)。

圖7

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