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Wang W.J. et al： Endonuclease G promotes autophagy by suppressing mTOR signaling and activating the DNA damage response

中文標題：內切酶G通過抑制mTOR信號傳導和激活DNA損傷反應來促進自噬

發(fā)表期刊：Nature Communications

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：17.694

發(fā)表時間：2021年8月

合作單位：暨南大學

運用技術：LC-MS/MS蛋白質譜鑒定（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

研究概述：

內切酶G (ENDOG)是一種線粒體核酸酶，已知參與許多細胞過程，但其在自噬中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)線粒體釋放的ENDOG促進饑餓期間的自噬。通過對人類細胞系、小鼠、果蠅和秀麗隱桿線蟲的實驗發(fā)現(xiàn)，這種自噬在物種間是進化保守的。在饑餓狀態(tài)下，糖原合成酶激酶3-β介導的ENDOG在Thr-128和Ser-288位點的磷酸化增強了其與14-3-3γ的相互作用，導致14-3-3γ釋放Tuberin (TSC2)和磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基3 (Vps34)，隨后mTOR途徑被抑制并開始自噬?；蛘?，ENDOG通過其內切酶活性激活DNA損傷反應并引發(fā)自噬。

研究結果：

1、ENDOG促進肝細胞中的自噬流

先前的研究證明ENDOG同源物CPS-6在秀麗隱桿線蟲受精時能調控自噬作用，那么ENDOG是否也能調控一般自噬呢？在人肝細胞系（L02和HepG2）中過表達ENDOG顯著增加了LC3B-II積累，降低了自噬底物SQSTM1表達，促進了自噬體形成（圖1a-d），而干擾ENDOG顯著抑制了許多核心ATG蛋白的表達和磷酸化。mCherry-GFP-LC3雙熒光指示實驗表明ENDOG過表達能增強肝細胞中的自噬流。ENDOG敲除細胞系在正常和應激條件下(饑餓、雷帕霉素和CQ處理)的自溶體形成被顯著抑制（圖1e-m），表明ENDOG促進自噬流。

圖1

2、ENDOG缺失抑制了多種物種中饑餓誘導的自噬

接著，研究者進一步探索了ENDOG在體內能否促進自噬以及該功能在不同物種間是否保守。與對照組相比，ENDOG敲除小鼠在饑餓處理后，其肝臟中的LC3B積累減少，SQSTM1表達增加，自噬小泡數(shù)量減少（圖2a-d）。饑餓處理后，ENDOG敲低果蠅的脂肪體細胞中mCherry-Atg8a（LC3同源物）的積累比未敲低組少（圖2e）。在正常和饑餓條件下，秀麗隱桿線蟲中ENDOG同源物cps-6的缺失均顯著降低了GFP的水平（圖2f）；在側線細胞和咽肌中，cps-6的缺失抑制了GFP::LGG-1（LC3同源物）點的數(shù)量（圖2g-h）。這些結果表明，在小鼠、果蠅和秀麗隱桿線蟲中，ENDOG促進自噬這一功能是保守的。

圖2

3、ENDOG通過抑制mTOR信號通路促進部分自噬

為了探索ENDOG誘導自噬的機制，研究者檢測了mTOR信號通路（自噬負調節(jié)因子）的參與情況。在人正常肝細胞L02及其他肝癌細胞系中，ENDOG的缺失都增加了mTOR及其底物的磷酸化水平（圖3a，b）。ENDOG敲除小鼠肝臟中的mTOR及其底物的磷酸化顯著增加（圖3c，d）。當使用RHEBQ64L來持續(xù)激活mTOR，發(fā)現(xiàn)其部分恢復了mTOR活性（圖3e、f），降低了ENDOG過表達細胞中LC3B-II的積累和自噬體的形成（圖3e–h）。但在ENDOG過表達的細胞中，LC3B-II的積累和自噬體的數(shù)量仍然多于RHEBQ64L過表達的野生型細胞。這些數(shù)據(jù)表明，ENDOG可部分通過抑制mTOR信號來促進自噬。

4、ENDOG通過與14-3-3γ相互作用抑制mTOR通路

隨后，研究人員進行了ENDOG的免疫共沉淀和質譜（IP-MS）法來進一步探索ENDOG通過mTOR促進自噬的機制。他們在質譜結果中發(fā)現(xiàn)可以調控mTOR活性的14-3-3γ。Co-IP WB實驗證實了14-3-3γ與ENDOG的相互作用。免疫熒光染色表明14-3-3γ與ENDOG共定位。

ENDOG是否影響14-3-3γ與其他自噬相關蛋白的相互作用呢？CoIP實驗發(fā)現(xiàn)，ENDOG的過表達抑制了TSC2/Vps34和14-3-3γ之間的相互作用（圖3i）。IP WB實驗還表明，饑餓處理略微增強了ENDOG和14-3-3γ之間的內源性相互作用，而削弱了TSC2/Vps34與14-3-3γ的相互作用（圖3j）。過表達14-3-3γ能重新激活mTOR途徑，減少LC3B-II的積累和SQSTM1的降解，并減少ENDOG過表達細胞中自噬體的形成（圖3k–m）。這些結果表明，ENDOG與14-3-3γ競爭性結合，使14-3-3γ釋放TSC2（mTOR的負調節(jié)因子）和Vps34，抑制mTOR通路并啟動自噬。

圖3

5、GSK-3β介導的ENDOG磷酸化增強了其與14-3-3γ的相互作用

已知14-3-3蛋白主要通過與靶蛋白的一般共有序列RXXpS/TXP結合而起磷酸化作用，預測發(fā)現(xiàn)ENDOG的T128和S288磷酸化可能分別與14-3-3γ的S59和E18形成氫鍵。因此，將ENDOG的T128和S288進行突變，T128/S288變?yōu)锳128/A288、T128/S288變?yōu)镈128/D288，以模擬非活性（AA）和活性形式（DD）。Co IP結果表明AA形式抑制了ENDOG和14-3-3γ之間的相互作用，DD形式增強了這種相互作用（圖4a，b）。而單獨的突變對它們的相互作用沒有影響。與野生型ENDOG和ENDOG-DD相比，ENDOG-AA在BafA1處理下的自噬體數(shù)量和LC3B-II積累較少（圖4c、d），且不能再抑制mTOR通路來促進LC3B-II積累和SQSTM1降解（圖4e，f）。此外，ENDOG在T128和S288的雙重磷酸化對于其與14-3-3γ的相互作用和自噬的誘導是必要的。

預測發(fā)現(xiàn)激酶AKT和GSK-3β可能磷酸化ENDOG的T128和S288。然而實驗表明，AKT過表達顯著降低了ENDOG磷酸化，GSK-3β過表達顯著增加了ENDOG磷酸化（圖4g，h），增強了ENDOG和14-3-3γ之間的相互作用（圖4g，h），但引入ENDOG的非活性形式（AA）后，這種作用被消除（圖4i，j）。體外磷酸化實驗也證實了GSK-3β磷酸化ENDOG（圖4k）。

圖4

6、ENDOG通過激活DNA損傷反應促進自噬

RHEBQ64L處理后ENDOG誘導的自噬僅部分恢復，推斷ENDOG促進的自噬中可能存在額外的途徑。DNA損傷反應是饑餓過程中的早期事件，由PARP-1/AMPK或ATM/CHK2途徑介導，在自噬中起著重要作用。實驗表明，ENDOG的缺失顯著抑制了饑餓誘導的DNA損傷（圖5a-e）。ENDOG敲除抑制了正常條件下PARP-1的表達和激活，阻斷了饑餓誘導的AMPK激活和mTOR抑制（圖5f，g），抑制了CHK1和CHK2的激活，從而抑制自噬（圖5h，i）。結果表明ENDOG誘導的DNA損傷可能促進饑餓過程中的自噬。

圖5

那么阻斷DNA損傷反應是否可以抑制ENDOG誘導的自噬呢？實驗表明， ENDOG增強了依托泊苷誘導的DNA損傷（圖6a-c）。同時，ENDOG敲除顯著抑制了DNA損傷反應（增加了p-H2A.X和p-ATM表達）（圖6d，e）。此外，依托泊苷處理的ENDOG敲除細胞的p-H2A.X顯著減少，并且在恢復期p-H2A.X的減少更快（圖6f，g）。這些數(shù)據(jù)表明ENDOG增強了DNA損傷反應。使用ATM特異性抑制劑KU-60019阻斷DNA損傷反應后，ENDOG誘導的DNA損傷、LC3BII積累、p-H2A.X水平和自噬體的數(shù)量顯著降低（圖6h-k）。但在KU60019的處理下，ENDOG過表達細胞仍然具有更多的p-H2A.X。這些數(shù)據(jù)表明，ENDOG還可以通過激活DNA損傷反應來誘導自噬。

圖6

6、ENDOG的核酸內切酶活性對自噬誘導至關重要

之后，研究者構建了各種突變體來確定ENDOG的哪個結構域對DNA損傷和自噬誘導至關重要（圖7a），將這些突變體過表達到ENDOG敲除細胞中，并用依托泊苷處理。與野生型、Del 1-48（刪除線粒體靶向序列）和ENDOG NLS（用核定位序列取代線粒體靶向序列）相比，EM ENDOG（突變氨基酸以消除其內切酶活性)過表達細胞中的p-mTOR、p-ULK1、p-p70S6K和SQSTM1表達更高，表明EM ENDOG失去了抑制mTOR活性和自噬促進的能力（圖7b，c）。除了EM形式，野生型和這些突變體在ENDOG敲除細胞中的過表達都影響了自噬流（圖7d、e）。彗星試驗結果也進一步證實了ENDOG核酸內切酶活性對誘導的DNA損傷反應和自噬至關重要。

先前的研究表明，caspase-8可裂解并激活Bid，而Bid介導ENDOG從線粒體轉移到細胞質，最終轉位到細胞核，導致染色質凝聚和DNA斷裂。為了探究caspase-8/Bid是否與本研究情況有關，研究者進一步試驗發(fā)現(xiàn)，caspase-8/Bid有助于線粒體釋放ENDOG，可能進一步促進自噬。

圖7