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中文標題：TLR4是高脂飲食下結(jié)直腸癌生長的主要調(diào)控因子

發(fā)表期刊：Cell Death & Disease

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：9.685

發(fā)表時間：2021年8月

合作單位：廣州中醫(yī)藥大學

運用技術(shù)：iTRAQ蛋白質(zhì)組學分析（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點擊查看服務詳情）

● 研究背景

研究表明，高脂肪飲食（HFD）與結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)展有關(guān)。Toll樣受體4 (TLR4)是一種跨膜的受體蛋白，能識別病原體并與之結(jié)合，啟動先天免疫。已知TLR4在結(jié)直腸癌(CRC)中過表達，促進了腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。棕櫚酸可以激活TLR4，但棕櫚酸是否影響CRC中TLR4的表達尚不清楚。本研究進一步探索了高脂肪飲食下CRC生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子及其作用機制。

● 研究結(jié)果

1. 高脂肪飲食增加了CRC中TLR4的表達

首先，研究人員將CRC細胞SW480接種到裸鼠體內(nèi)，建立異種移植模型，并將小鼠隨機分為兩組：高脂肪飲食喂養(yǎng)組(HD組)和對照飲食喂養(yǎng)組(CD組)，15天后，HD組的腫瘤大小和重量均大于CD組(圖1A)。之后，在HD組中隨機選擇一半的小鼠進行對照飼料喂養(yǎng)(HCD組)，而其余小鼠繼續(xù)喂食HFD (HHD組)20天(圖1A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCD組的腫瘤大小和重量明顯小于HHD組(圖1A)。接下來的轉(zhuǎn)錄組測序調(diào)查了不同喂養(yǎng)條件下CRC的基因表達譜差異，在檢測到的19707個基因中，331個基因在，HHD樣本中上調(diào)，1189個基因下調(diào)(圖1B)，GO富集分析顯示，受飲食影響的基因大部分參與細胞代謝過程(圖1C)。研究人員發(fā)現(xiàn)，在10個TLR同源物中，HFD喂養(yǎng)使TLR4上調(diào)了4倍。qPCR（圖1D）和WB檢測(圖1E)均顯示，TLR4在HD組表達較高，在HCD組表達降低，在HHD組的水平持續(xù)升高（圖1D）。以上可知，HFD增加了CRC中TLR4的表達。

  圖1

2. 棕櫚酸增加CRC細胞中TLR4的表達

HFD如何影響CRC中TLR4的表達呢？脂質(zhì)組學研究了不同飲食下CRC的脂質(zhì)變化，主成分分析顯示，飲食干預影響了CRC的脂質(zhì)譜(圖2A)。與CD組相比，HD組總脂肪酸水平較高，HCD組總脂肪酸水平降低，HHD組總脂肪酸水平持續(xù)升高(圖2B)。靶向脂質(zhì)組學結(jié)果顯示，棕櫚酸和硬脂酸水平隨飲食干預而變化，推測其可能影響TLR4的表達。體外細胞實驗顯示，棕櫚酸處理顯著提高了SW480細胞(圖2C)和HCT116細胞(圖2D)的TLR4 mRNA水平和蛋白水平(圖2E, F)。然而，硬脂酸不影響TLR4的表達(圖2G, H)。這些結(jié)果表明，HFD增加了CRC中的棕櫚酸和硬脂酸水平，但只有棕櫚酸增加了TLR4的表達。

圖2

3. PU.1的表達對棕櫚酸增強TLR4的表達至關(guān)重要

接著，他們研究了CRC細胞中棕櫚酸是否影響TLR4基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理顯著增加了TLR4啟動子上的2個已知轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PU.1和Sp1的mRNA (圖3A, C, E, G)和蛋白表達(圖3B, D ,F ,H)。在棕櫚酸處理前分別敲低SP1和PU.1（圖3I、K），發(fā)現(xiàn)只有當Sp1敲低時，棕櫚酸顯著增加了TLR4的表達 (圖3J, L)，表明PU.1是CRC中棕櫚酸增強TLR4表達所必需的。根據(jù)以往TLR4啟動子上PU.1結(jié)合位點的報道（圖3M），研究人員進行了雙熒光素酶實驗。結(jié)果顯示，棕櫚酸顯著提高了TLR4啟動子的活性，但PU.1_1、PU.1_2和PU.1_5的突變均消除了這種活性促進作用(圖3N)，表明- 106、-172和-204位點的PU.1結(jié)合位點對棕櫚酸介導的TLR4轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。

圖3

4. 棕櫚酸依賴TLR4來促進CRC細胞增殖

棕櫚酸不僅增加了CRC細胞中TLR4的表達，還增加了MyD88和TIRAP的表達(圖4A, B)。然而，表面等離子體共振(SPR)結(jié)果發(fā)現(xiàn)棕櫚酸不與TLR4結(jié)合(圖4C)。棕櫚酸處理后NFκB磷酸化增強(圖4D, E)，表明TLR4信號通路的激活至少部分是由于癌細胞中TLR4、MyD88和TIRAP表達的增強，而不是由于棕櫚酸與TLR4蛋白的直接結(jié)合。此外，棕櫚酸增加了CRC細胞的增殖，而TLR4抑制劑C34會消除這種作用 (圖4F, G)。為了進一步表明TLR4介導了棕櫚酸對CRC細胞增殖的促進，他們敲除了HCT116細胞中的TLR4 (圖4H)，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸不能增加TLR4_KO細胞的增殖(圖4I)。這些數(shù)據(jù)表明棕櫚酸以TLR4依賴的方式增加結(jié)直腸癌細胞的增殖。

圖4

5. HFD或富棕櫚酸飲食(PAD)以TLR4依賴的方式增加結(jié)直腸癌的生長

接下來，他們研究了體內(nèi)TLR4是否介導了HFD相關(guān)的結(jié)直腸癌生長。將野生型HCT116細胞或敲除TLR4的HCT116細胞皮下接種于裸鼠，并隨機分為HFD組和CD組。HFD飼料的總脂肪酸為254.5 g，其中棕櫚酸含量為49.9 g，占總脂肪酸的19.6%。另一組小鼠飼喂富含棕櫚酸的飼料，其中棕櫚酸含量為106.5 g，脂肪酸含量為262.8 g，棕櫚酸占總脂肪酸的40.5%。各組之間的食物攝取量沒有明顯差異。在18天的飲食干預期間，飲食對小鼠的體重沒有顯著影響(圖5A, B)。然而，對于接種野生型HCT116細胞的小鼠來說，HFD和PAD分別顯著增加了腫瘤體積(圖5C, E)和重量(圖5F)。對于接種HCT116TLR4_KO細胞的小鼠，HFD和PAD均未能增加腫瘤體積(圖5D, E)和重量。這些數(shù)據(jù)表明HFD和PAD在體內(nèi)以TLR4依賴的方式增加CRC的生長。

圖5

6. TLR4調(diào)節(jié)HFD條件下的CRC代謝

TLR4是否通過調(diào)節(jié)腫瘤代謝促進HFD條件下的CRC生長呢？研究人員發(fā)現(xiàn)，敲除TLR4后，腫瘤組織中乙酰輔酶a羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FASN)、肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1 (cct -1)、中鏈?；o酶a脫氫酶(MCAD)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1以及調(diào)節(jié)細胞脂肪生成和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子-甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-1 (SREBP-1c)的表達顯著增強（圖6A）?；谀[瘤組織的iTRAQ蛋白質(zhì)組學結(jié)果，敲除TLR4改變了CRC的代謝(圖6B-D)，還影響了其他代謝酶，這些代謝酶位于線粒體或細胞質(zhì)，主要參與能量產(chǎn)生，并協(xié)同參與甘油三酯生物合成、葡萄糖代謝、脂肪酸活化、脂肪酸、甘油三酯和酮類合成。STRING分析(圖6E)所示，TLR4對HFD條件下CRC代謝的調(diào)節(jié)作用不是單個代謝酶的作用，而是多種酶的協(xié)同作用。敲除TLR4消除了CRC中HFD引起的ATP水平升高（圖6F）和β-catenin表達上調(diào) (圖6G)，表明在HFD條件下，CRC中β-catenin調(diào)節(jié)的能量穩(wěn)態(tài)與TLR4活性有關(guān)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明TLR4通過控制代謝來調(diào)節(jié)HFD下結(jié)直腸癌的生長。

圖6

●   總結(jié)

在本研究中，脂質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)顯示，高脂肪飲食不僅增加了CRC小鼠模型的腫瘤重量，還增加了棕櫚酸水平和TLR4表達。棕櫚酸通過PU.1蛋白調(diào)控TLR4的表達。iTRAQ蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)顯示，TLR4敲低改變了腫瘤組織中的代謝酶譜，從而完全消除了高脂肪飲食對ATP產(chǎn)生和腫瘤生長的促進作用。

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