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Niu J . et al: Phospholipid peroxidation-driven modification of chondrogenic transcription factor mediates alkoxyl radicals-induced impairment of embryonic bone development

中文標題：磷脂過氧化驅動的軟骨生成轉錄因子修飾介導了烷氧基誘導的胚胎骨發(fā)育損傷

發(fā)表期刊：Redox Biology

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：10.787

發(fā)表時間：2022年8月

合作單位：暨南大學

運用技術：iTRAQ蛋白質組學分析（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

● 研究背景

產前母親壓力與分娩不良有關，比如早產、嬰兒死亡率高或出生體重低等。母體壓力引起的胚胎骨發(fā)育不良是一種典型的發(fā)育障礙，被認為是氧化應激損傷導致的，但其具體機制尚不明確。子宮發(fā)生內源性氧化還原反應或受到外源刺激都會形成各種自由基（如烷氧基自由基）并傳遞給胚胎，使胚胎受到氧化損傷。2,2′-偶氮雙[2-甲基丙脒]二鹽化物(AAPH)是一種經典的烷氧基自由基生成物，被廣泛應用于氧化應激相關的研究，本項目利用AAPH深入探討了烷氧基自由基誘導雞胚胎骨發(fā)育缺陷的確切機制。

● 研究結果

1. 烷氧基自由基會延緩胚胎骨骼發(fā)育

首先，研究人員通過注射AAPH建立雞胚胎慢性氧化應激模型：在胚胎發(fā)育第1.5天開始注射，之后每隔一天注射一次，共注射5次（圖1A）。胚胎發(fā)育第17天時，AAPH處理的胚胎死亡率顯著升高（圖1B）、胚胎重量減少（圖1C）、肢體生長遲緩（圖1D）。為了確定在軟骨內骨形成過程中是否已經發(fā)生肢體畸形，對胚胎發(fā)育第7天的胚胎軟骨進行染色，結果與第17天一致，都呈現較短的肢體（圖1E）。軟骨內骨化是胎兒早期肢體發(fā)育的關鍵步驟，可分為停滯區(qū)、增殖區(qū)（PZ）、肥大區(qū)和鈣化區(qū)（圖1F）。對脛骨生長板的石蠟切片進行H&E染色（圖1G），發(fā)現AAPH處理導致PZ的結構被破壞、長度縮短（圖1H）。這些結果表明烷氧基自由基誘導的氧化應激導致了軟骨發(fā)育異常，從而阻礙了胚胎骨生長。

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圖1

2. 鐵下垂與烷氧基自由基誘導的軟骨發(fā)育缺陷有關

為了確定氧化應激誘導異常軟骨發(fā)生的分子機制，研究人員對AAPH處理和對照的雞胚軟骨組織進行了iTRAQ標記蛋白質組學分析（圖2A），共鑒定出1534種可信蛋白質（置信度≥95%），其中16種蛋白質上調，2種蛋白質下調（圖2B）。此外，富集分析顯示，差異表達蛋白富集在鐵離子結合途徑中（圖2C）；KEGG分析表明，差異蛋白富集在鐵下垂途徑、花生四烯酸代謝、肌動蛋白細胞骨架調控途徑等（圖2D和E）。之后，western blot實驗驗證了與鐵下垂相關的關鍵差異蛋白（圖2F），其中DMT1和TFR1蛋白在AAPH組表達升高，GPX4和SLC7A11蛋白在AAPH組表達降低（圖2G）。此外，AAPH處理還可促進MDA產生和GSH消耗（圖2H和I），并顯著降低骨組織中GPX和SOD的活性（圖2J和K）。用鐵下垂誘導劑RSL3處理雞胚，當劑量在1.0至10.0 nM之間時，胚胎死亡率顯著增加（圖2L），胚胎重量顯著降低（圖2M）。阿爾西安藍染色表明RSL3處理顯著抑制了胚胎肢體的生長（圖2N）。這些結果說明，鐵下垂在氧化應激誘導的骨發(fā)育障礙中起重要作用。

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圖2

3. 鐵下垂抑制劑減輕了烷氧基自由基誘導的軟骨發(fā)育缺陷

為了證實鐵下垂在異常骨發(fā)育中的作用，在體內使用了Fer-1和DFO。Fer-1減輕了胚胎發(fā)育第17天AAPH處理組的雞胚死亡率上升（圖4A）和重量下降（圖4B）；Fer-1也能減弱AAPH對脛骨生長的抑制（圖4C和D）。H&E染色顯示，Fer-1處理恢復了發(fā)育的骨骼中脛骨PZ的收縮（圖4E和F）。DFO處理的雞胚也觀察到類似趨勢。與發(fā)育第17天一樣，AAPH處理也加重了發(fā)育第7天的胚胎死亡率和重量下降（圖4G和H）。DFO顯著緩解了AAPH引起的脛骨縮短（圖4I和J）。

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圖3

4. 烷氧基自由基會引發(fā)軟骨細胞鐵過載

鐵是芬頓反應傳播磷脂過氧化所必需的。DMT1和TFR1是兩種主要的鐵轉運蛋白，有助于細胞中的鐵代謝。對DMT1和TFR1表達水平的ITAQ檢測（圖2A）和WB檢測（圖2G）說明鐵參與了烷氧基自由基阻礙軟骨形成的過程。接下來，研究人員檢測了軟骨細胞中鐵的變化。AAPH/RSL3處理的細胞中Fe2+水平較高，Fer-1和DFO處理會降低Fe2+水平（圖5A-C）。為了進一步了解鐵在軟骨形成中的作用，用siRNA干擾鐵下垂相關蛋白DMT1的表達（圖5D），這逆轉了AAPH對成骨相關基因BMP6、COL2A1和ACAN的抑制作用（圖5E）。以上體外研究結果說明，鐵過載在氧化應激干擾胚胎成骨過程中起關鍵作用。

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圖4

5. 富含烷氧基自由基的軟骨細胞中，氧化磷脂（OxPL）的積累抑制軟骨生成

磷脂雙烯丙基位置的PUFA氧化是過氧化和鐵下垂的驅動因素，研究人員利用C11-BODIPY染色測量了脂質過氧化水平（圖6A），結果顯示AAPH或Erastin處理導致了細胞中脂質過氧化產物的積累，而Fer-1處理抑制了脂質過氧化。通過氧化還原脂質組學分析確定了五大類氧化磷脂（OxPL）：磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰基絲氨酸（PS）、磷脂基甘油（PG）和磷脂酰肌醇（PI）（圖6B）。與對照組相比，AAPH組表現出明顯的脂質過氧化模式（圖6C），單氧化和二氧化磷脂種類大量增加（圖6D和E）。1-硬脂酰-2-花生四烯酰磷脂酰乙醇胺（SAPE-OOH）能否直接促進骨骼發(fā)育呢？用外源性SAPE-OOH處理ATDC5細胞后，Bmp6、Co12a1和Acan等骨發(fā)育有關基因的表達被抑制（圖6F）。這些結果說明富含烷氧基自由基的軟骨細胞中的OxPL積累，抑制了軟骨形成過程。

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圖5

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圖6

6. 4-HNE修飾驅動了SOX9蛋白的泛素依賴性降解

轉錄因子SOX9是軟骨發(fā)生的關鍵調節(jié)因子。結果顯示，AAPH處理降低了SOX9蛋白水平而非mRNA水平（圖7A和B），也嚴重干擾了軟骨發(fā)生相關基因的表達，DFO處理能逆轉這些變化（圖7C）。4-HNE是脂質過氧化的最終產物，能夠與多種蛋白質反應形成HNE蛋白質加合物，改變其活性或誘導其降解。研究者發(fā)現4-HNE結合蛋白水平在AAPH處理后顯著增加（圖7D）。那么SOX9蛋白的下調是否與4-HNE修飾相關？Co-IP結果表明，AAPH處理導致與4-HNE結合的SOX9增多（圖7E）。免疫熒光染色進一步證實了4-HNE和SOX9的共定位（圖7F）。正如預期，DMT1干擾削弱了SOX9與4-HNE的結合（圖7G）。CHX實驗表明，外源4-HNE處理顯著促進了SOX9蛋白的降解（圖7H），但蛋白酶體抑制劑MG132抑制了AAPH導致的SOX9蛋白水平下降，自噬抑制劑3-MA幾乎沒有作用（圖7I）。用泛素和SOX9質粒共轉染SW1353細胞，AAPH處理促進了SOX9的K48泛素化，DMT1-siRNA逆轉了這一結果（圖7J和K）。這些發(fā)現表明，在軟骨細胞中，脂質過氧化最終產物4-HNE通過蛋白質修飾來調節(jié)SOX9的泛素-蛋白酶體降解。

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