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中文標(biāo)題：植物ESCRT組分FREE1穿梭到細(xì)胞核以減弱脫落酸信號(hào)

發(fā)表期刊：Nature Plants

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：17.352

發(fā)表時(shí)間：2019年

合作單位：華南師范大學(xué)

運(yùn)用技術(shù)：IP-MS/MS磷酸化位點(diǎn)檢測(cè)（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（ESCRT）是真核生物中存在的保守的囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)器，由20多個(gè)蛋白組成并分成ESCRT-0, -I, -II, -III以及VPS4/SKD1-LIP5等5個(gè)蛋白復(fù)合物，它們協(xié)同作用識(shí)別泛素化修飾的膜蛋白并將其分選到細(xì)胞內(nèi)多泡體（MVB）的內(nèi)小泡中，這樣當(dāng)多泡體與液泡融合后，膜蛋白即被運(yùn)輸至液泡內(nèi)腔而被降解。已有研究表明，ESCRT蛋白參與了植物激素脫落酸(ABA)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。作者團(tuán)隊(duì)前期已經(jīng)發(fā)掘了植物特有的ESCRT復(fù)合物組分FREE1，并解析了其調(diào)控膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和自噬降解的功能，而有關(guān)ESCRT蛋白通過(guò)何組分以及哪種途徑參與植物激素脫r落酸(ABA)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，仍有待進(jìn)一步研究。

● 研究結(jié)果

1.     通過(guò)使用新創(chuàng)建的free1-ctmut植物,發(fā)現(xiàn)FREE1的C-末端盤(pán)繞線圈結(jié)構(gòu)域賦予ABA超敏反應(yīng)

在這項(xiàng)研究中，研究者利用CRISPR-Cas9技術(shù)繞過(guò)FREE1功能缺失的致死性，得到一個(gè)特異影響FREE1蛋白入核的突變體Free1-ctmut。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示該突變體倒數(shù)第二個(gè)外顯子內(nèi)有8bp的缺失(圖1A)，這導(dǎo)致FREE1蛋白序列在581個(gè)氨基酸位點(diǎn)上有一個(gè)提前終止密碼子，引入了558-581個(gè)氨基酸殘基的外源多肽(圖1B)。WB分析檢測(cè)到Free1-ctmut植物中較小的內(nèi)源FREE1，表明產(chǎn)生了截短的FREE1蛋白，并缺失了羧基末端的尾巴(圖1C)。Free1-ctmut突變體在正常生長(zhǎng)條件下沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的表型，但與野生型(WT)植株相比，對(duì)ABA介導(dǎo)的抑制成苗和ABA誘導(dǎo)的離體葉片衰老表現(xiàn)出更高的敏感性。

FREE1蛋白有三個(gè)已知的結(jié)構(gòu)域，包括氨基末端的固有無(wú)序區(qū)、FYVE結(jié)構(gòu)域和C-末端卷曲圈區(qū)。為了深入了解FREE1蛋白不同結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)Free1-ctmut植株脫落酸(ABA)敏感性中的作用，本研究將4個(gè)不同版本的綠色熒光蛋白分別與FREE1、Free1-ctmut、FREE1(?FYVE)和FREE1(?CC)融合到Free1-ctmut中，并對(duì)其進(jìn)行了表型分析。如圖1D-F所示，全長(zhǎng)FREE1完全補(bǔ)充了Free1-ctmut的ABA敏感表型，而C-末端截短的Free1-ctmut和FREE1(?CC)未能補(bǔ)充Free1-ctmut的表型，突出了FREE1 C末端在賦予Free1-ctmut植物的ABA超敏感表型中的功能重要性。先前的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)REE1的N端部分負(fù)責(zé)其與ABA受體的相互作用，而這個(gè)新建立的Free1-ctmut植物中，缺失部分位于C端卷曲區(qū)域(圖1)，理論上不影響FREE1與ABA受體的相互作用。因此，F(xiàn)ree1-ctmut的ABA超敏反應(yīng)不太可能是由MVB介導(dǎo)的空泡分選缺陷和ABA受體的降解引起的。研究者通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證猜想，并得出結(jié)論：Free1-ctmut作為ESCRT組分正常發(fā)揮作用，F(xiàn)REE1通過(guò)C末端負(fù)性調(diào)節(jié)ABA反應(yīng)，其機(jī)制不同于先前報(bào)道的FREE1調(diào)節(jié)ABA受體內(nèi)體分選的功能。

圖1

2. ABA促進(jìn)FREE1核輸入，核定位的FREE1補(bǔ)充FREE1-ctmut對(duì)ABA的超敏反應(yīng)

接下來(lái)，研究者使用先前建立的GFP-FREE1/FREE1互補(bǔ)系觀察了FREE1亞細(xì)胞定位模式對(duì)ABA的響應(yīng)。有趣的是，ABA處理導(dǎo)致在共聚焦顯微鏡下觀察到的細(xì)胞核中GFP-FREE1的水平顯著增加，并在免疫印跡分析中檢測(cè)到。(圖2A，B)。此外，WT植株細(xì)胞核中內(nèi)源FREE1水平的增加對(duì)ABA的響應(yīng)進(jìn)一步支持了ABA促進(jìn)FREE1核進(jìn)入的結(jié)論(圖2C)。此外，在GFP-FREE1-CTmut/Free1-ctmut系(圖2D)中，細(xì)胞核中GFP-FREE1-CTmut的水平?jīng)]有明顯增加。此外，F(xiàn)REE1抗體的WB分析進(jìn)一步證實(shí)，內(nèi)源FREE1-CTmut蛋白未能對(duì)ABA做出反應(yīng)而移位到細(xì)胞核(圖2E)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)REE1可能通過(guò)其在細(xì)胞核內(nèi)的作用發(fā)揮其對(duì)ABA信號(hào)的抑制作用，而FREE1的C末端對(duì)于其穿梭到細(xì)胞核和植物對(duì)ABA的響應(yīng)是必不可少的。為了提高FREE1在細(xì)胞核中的表達(dá)水平，研究者建立了GFP-FREE1-NLS/FREE1-ctmut和GFP-FREE1-NES(Mut)/FREE1-ctmut轉(zhuǎn)基因株系。GFP-FREE1-NLS顯示顯性的細(xì)胞核定位，而GFP-FREE1-NES(Mut)在沒(méi)有ABA處理的情況下核定位明顯增加(圖2F)。進(jìn)一步的表型分析表明，GFP-FREE1-NLS和GFP-FREE1-NES(Mut)都能夠補(bǔ)充FREE1-ctmut對(duì)ABA的超敏表型(圖2G，H)。綜上所述，ABA處理促進(jìn)了FREE1的核積累，但不促進(jìn)FREE1-CTmut的核積累，次外，F(xiàn)REE1的核積累能夠補(bǔ)充FREE1-ctmut對(duì)ABA的敏感表型。

圖2

3. ABA促進(jìn)FREE1磷酸化，磷酸化的FREE1主要定位于細(xì)胞核

大量研究表明，磷酸化修飾可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)核質(zhì)穿梭。為了驗(yàn)證FREE1在用ABA處理時(shí)是否會(huì)發(fā)生磷酸化修飾，研究者檢測(cè)了有或沒(méi)有ABA處理的FREE1的磷酸化水平，結(jié)果顯示ABA處理顯著增加了FREE1的磷酸化水平（圖3A）。在GFP-FREE1CTmut/FREE1-CTmut系中檢測(cè)FREE1-CTmut的磷酸化水平，結(jié)果表明，F(xiàn)REE1-CTmut磷酸化水平的增加遠(yuǎn)小于FREE1（圖3A），這表明ABA誘導(dǎo)的FREE1磷酸化需要C端。接下來(lái)，研究者在核和胞質(zhì)組分中檢測(cè)有無(wú)ABA處理的FREE1磷酸化水平，結(jié)果表明，磷酸化的FREE1主要位于細(xì)胞核中（圖3B），表明FREE1可能需要進(jìn)行磷酸化修飾才能在細(xì)胞核中積累。后續(xù)的時(shí)程和劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明，ABA能夠誘導(dǎo)FREE1磷酸化，這需要FREE1的C末端；磷酸化的FREE1主要位于細(xì)胞核中。

圖3

4. 依賴于SnRK2.2/2.3的FREE1磷酸化是ABA誘導(dǎo)的FREE1核輸入所必需的

多研究表明，SnRK2分支蛋白激酶，包括SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6，是介導(dǎo)植物對(duì)ABA反應(yīng)的關(guān)鍵正調(diào)控因子，ABA強(qiáng)烈激活A(yù)BA以進(jìn)一步磷酸化下游因子。為了測(cè)試SnRK2激酶是否磷酸化FREE1對(duì)ABA的響應(yīng)，研究者通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)(BIFC)等分析證實(shí)了FREE1與SnRK2.2/2.3在擬南芥葉片原生質(zhì)體的細(xì)胞核和胞漿中的相互作用(圖3C）。Co-IP結(jié)果表明，ABA處理增強(qiáng)了FREE1與SnRK2.2和SnRK2.3之間的聯(lián)系(圖3D)。接下來(lái)，研究者利用幾個(gè)含有結(jié)構(gòu)域截?cái)嗟腇REE1突變體，用于與SnRK2的相互作用分析。結(jié)果表明，F(xiàn)REE1的C-末端卷曲區(qū)負(fù)責(zé)與SnRK2.2和SnRK2.3的相互作用。

接下來(lái)，研究者進(jìn)行了體外磷酸化實(shí)驗(yàn)，以測(cè)試SnRK2激酶是否直接磷酸化FREE1。將純化的His-SUMO-FREE1分別與ABA處理的轉(zhuǎn)基因植物GFP-SnRK2蛋白和大腸桿菌His-MBP-SnRK2蛋白孵育。在這兩種情況下，His-SUMO-FREE1的磷酸化都很容易檢測(cè)到(圖3E)。此外，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SnRK2.2和SnRK2.3是ABA誘導(dǎo)FREE1磷酸化的預(yù)期激酶蛋白。為了進(jìn)一步揭示ABA誘導(dǎo)和SnRK2S依賴的FREE1磷酸化是否與ABA誘導(dǎo)的FREE1核導(dǎo)入有關(guān)，研究者將GFP-FREE1導(dǎo)入現(xiàn)有SnRK2.2/2.3/2.6三重突變體的葉片原生質(zhì)體中，在ABA處理后的SnRK2.2/2.3/2.6原生質(zhì)體中沒(méi)有觀察到明顯的FREE1核導(dǎo)入增加(圖3F)。這一觀察結(jié)果得到證據(jù)的支持，即在ABA處理后，SnRK2.2/2.3/2.6三重突變體細(xì)胞核中內(nèi)源性FREE1的水平?jīng)]有明顯增加(圖3G)。綜上所述，這些結(jié)果表明，依賴于SnRK2.2和SnRK2.3的FREE1磷酸化對(duì)于ABA誘導(dǎo)的FREE1核進(jìn)口是必要的。

5. ABA誘導(dǎo)的FREE1核進(jìn)口需要絲氨酸殘基S530/S533的磷酸化

為了確定相應(yīng)的FREE1磷酸化殘基對(duì)ABA的響應(yīng)，研究者對(duì)免疫沉淀的GFP-FREE1和GFP-Free1-ctmut蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示，在GFP-Free1-ctmut蛋白中檢測(cè)到的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)S530和S533位于FREE1 C-末端卷曲圈區(qū)，而GFP-FREE1-CTmut蛋白中檢測(cè)不到。Free1-ctmut蛋白的缺失可能破壞了盤(pán)繞區(qū)域的結(jié)構(gòu)，從而降低了S530和S533的磷酸化。因此，我們將目前的研究重點(diǎn)放在S530和S533在誘導(dǎo)ABA反應(yīng)中的功能特性上。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證S530和S533的磷酸化是否參與了ABA誘導(dǎo)的FREE1核輸入，我們將YFP-FREE1(S530A/S533A)和YFP-FREE1(S530D/S533D)這兩個(gè)絲氨酸位點(diǎn)突變?yōu)榉橇姿峄谋彼峄蛄姿峄奶於彼釟埢?，引入到FREE1突變株中，進(jìn)行FREE1定位觀察和植物表型分析。對(duì)ABA處理和未處理的植株不同蛋白質(zhì)組分的共聚焦觀察和免疫印跡分析均未發(fā)現(xiàn)YFP-FREE1(S530A/S533A)在細(xì)胞核內(nèi)明顯積聚(圖4B，C)。相反，YFP-FREE1(S530D/S533D)在沒(méi)有ABA處理的補(bǔ)充植株中表現(xiàn)出明顯的核積累(圖4D，E)。此外，與免疫沉淀-質(zhì)譜結(jié)果一致，ABA處理的轉(zhuǎn)基因植株和體外磷酸化實(shí)驗(yàn)中純化的His-SUMO-FREE1(S530A/S533A)的YFPFREE1(S530A/S533A)的磷酸化水平都明顯降低(圖3E、4F)。YFP-FREE1(S530A/S533A)/Free1-ctmut表現(xiàn)出與Free1-ctmut相似的ABA過(guò)敏性，而YFP-FREE1(S530D/S533D)/Free1-ctmut在成苗和ABA誘導(dǎo)的葉片衰老方面與WT相似(圖4G，H)，進(jìn)一步支持S530/S533的磷酸化是必需的。

圖4

6. FREE1通過(guò)抑制ABF4和ABI5的DNA結(jié)合能力來(lái)抑制ABF4和ABI5的轉(zhuǎn)錄活性

為了研究FREE1在細(xì)胞核中的功能對(duì)ABA的響應(yīng)，研究者以FREE1(231-601)的C末端部分為誘餌，在擬南芥互補(bǔ)DNA文庫(kù)中進(jìn)行了酵母雙雜交篩選，在陽(yáng)性克隆鑒定了編碼轉(zhuǎn)錄激活因子ABF4和ABI5的克隆，用于進(jìn)一步的蛋白質(zhì)相互作用分析。酵母雙雜交結(jié)果顯示，ABF4和ABI5都與FREE1(231-601)相互作用(圖5A)，BIFC分析進(jìn)一步證實(shí)了這種相互作用(圖5B)。在酵母雙雜交試驗(yàn)中進(jìn)一步的精細(xì)定位表明，F(xiàn)ree1-ctmut(231-581)失去了與ABF4和ABI5的相互作用，而缺失了N末端的FREE1(421-601)仍然可以與這些轉(zhuǎn)錄因子相互作用。這些結(jié)果表明，F(xiàn)REE1的C端螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)ｉT(mén)負(fù)責(zé)與ABF4和ABI5的DNA結(jié)合域的相互作用(圖5A)。免疫共沉淀試驗(yàn)表明，在沒(méi)有ABA的情況下，F(xiàn)REE1與ABF4或ABI5之間的相互作用很弱，但在ABA處理后得到加強(qiáng)(圖5C，D)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)REE1C-末端殘基的磷酸化在調(diào)節(jié)ABA反應(yīng)中起著重要作用。

為了確定FREE1是否影響ABF4和ABI5在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活活性，研究者在擬南芥原生質(zhì)體中進(jìn)行了雙熒光素酶的報(bào)告實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在ABF4或ABI5單獨(dú)存在的情況下，ABA顯著誘導(dǎo)PAO1或EM6的表達(dá)，當(dāng)與GFP-FREE1共表達(dá)時(shí)，這種誘導(dǎo)被顯著抑制，但與GFP對(duì)照(圖5E，F(xiàn))不同，這表明FREE1直接抑制ABF4和ABI5對(duì)ABA的轉(zhuǎn)錄激活活性。接下來(lái)，為了檢測(cè)FREE1是否通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域來(lái)抑制這兩種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性，研究者通過(guò)電泳遷移率改變分析(EMSA)研究了FREE1對(duì)這兩種轉(zhuǎn)錄因子與下游基因順式調(diào)控序列結(jié)合活性的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)REE1，而不是GFP對(duì)照，以劑量依賴的方式抑制ABF4和ABI5的DNA結(jié)合能力(圖5G，H)，說(shuō)明了FREE1對(duì)ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄激活活性的直接抑制作用。利用ChIP-qPCR方法進(jìn)一步檢測(cè)Free1-ctmut突變是否會(huì)導(dǎo)致GFP-ABF4和GFP-ABI5對(duì)其靶基因啟動(dòng)子序列的富集作用增強(qiáng)，并以GFP為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，F(xiàn)REE1確實(shí)減弱了ABF4和ABI5對(duì)下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA結(jié)合能力(圖5I，J)。

圖5

7. ABF4或ABI5的缺失挽救了在Free1-ctmut突變體中產(chǎn)生的ABA超敏表型

Free1-ctmut突變體對(duì)ABA的超敏表型很可能主要是由于ABF4和ABI5在細(xì)胞核內(nèi)過(guò)度激活而沒(méi)有FREE1抑制所致。為了證實(shí)這種可能性，研究者測(cè)試了ABF4或ABI5的缺失是否會(huì)通過(guò)使Free1-ctmut與ABF4或ABI5突變體雜交來(lái)挽救在Free1-ctmut突變體中觀察到的ABA超敏表型。與預(yù)期一致，F(xiàn)ree1-ctmut的ABF4或ABI5突變?cè)诔擅绾虯BA誘導(dǎo)的葉片衰老方面都表現(xiàn)出WT ABA反應(yīng)(圖6A，B)，即Free1-ctmut的ABA敏感表型可能是由ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄活性的過(guò)度激活引起的。此外，接下來(lái)，研究者檢測(cè)了ABA反應(yīng)基因NYE1、NYC1、PAO1、RD29A、RD29B、NYE2和SAG29在WT、Free1-ctmut突變體ABF4、ABI5、Free1-ctmut/ABF4和Free1-ctmut/ABI5中的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，所有檢測(cè)到的基因在未經(jīng)ABA處理的Free1-ctmut突變體中的表達(dá)均升高，而在ABA處理下，表達(dá)誘導(dǎo)的升高更為顯著。然而，ABF4或ABI5突變消除了Free1-ctmut中ABA反應(yīng)基因的這種表達(dá)誘導(dǎo)(圖6C，D)?？傊@些結(jié)果表明，在Free1-ctmut中ABA反應(yīng)基因的表達(dá)上調(diào)是由于ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄活性的過(guò)度激活所致。

圖6

● 結(jié)論

研究在轉(zhuǎn)錄水平上證明了細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)和ABA信號(hào)之間的串?dāng)_，并強(qiáng)調(diào)了植物ESCRT亞基FREE1的兼職特性，它除了在細(xì)胞質(zhì)中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用外，還在細(xì)胞核中進(jìn)化了獨(dú)特的非內(nèi)體功能。

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