中文標(biāo)題：MEX3A/circMPP6復(fù)合體通過抑制自噬促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)展

發(fā)表期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：40.8

發(fā)表時(shí)間：2024.04

合作單位：中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

運(yùn)用技術(shù)：IP MS結(jié)合蛋白鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

背景：

P小體（PBs）是細(xì)胞質(zhì)中的一種無膜細(xì)胞器，也被稱為細(xì)胞質(zhì)加工小體，通過液-液相分離(LLPS)形成，是由RNA和RBP組成的一個(gè)聚集體，其功能主要涉及?mRNA的降解和翻譯的抑制。

已知PBs穩(wěn)態(tài)與缺氧、營養(yǎng)饑餓等多種應(yīng)激密切相關(guān)，鑒于應(yīng)激條件在腫瘤微環(huán)境中的重要作用，推測PBs形成的失調(diào)可能在腫瘤病理過程中發(fā)揮作用。mex3 RNA結(jié)合家族成員A (MEX3A)是一種RBP，與各種RNA代謝有關(guān)，包括mRNA穩(wěn)定性、miRNA在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的轉(zhuǎn)運(yùn)。越來越多的證據(jù)表明，MEX3A參與了多種癌癥的進(jìn)展。circRNAs主要通過海綿作用microRNA或與RBP相互作用來發(fā)揮功能。此外，circRNAs可以作為蛋白質(zhì)的誘餌、支架和招募者，影響蛋白質(zhì)的相互作用或定位。

內(nèi)容概述：

2024年4月，中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的研究人員在國際期刊Signal Transduction and Targeted Therapy上發(fā)表新論文，描述了MEX3A在結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性特性和自噬活性中的作用。研究結(jié)果表明，MEX3A經(jīng)歷LLPS并協(xié)調(diào)活細(xì)胞中PBs成分的募集。circMPP6作為關(guān)鍵支架，促進(jìn)了MEX3A和PBs組分之間的相互作用，進(jìn)而促進(jìn)了CRC細(xì)胞中PBs的形成。MEX3A/circMPP6復(fù)合物可以影響PDE5A mRNA的降解，從而引發(fā)CRC細(xì)胞的侵襲性。臨床上看，MEX3A表達(dá)高、PDE5A表達(dá)低的結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差?？偟膩碚f，該論文揭示了RBP/circRNA復(fù)合物在調(diào)節(jié)PBs穩(wěn)態(tài)中的重要作用，為結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評估和治療干預(yù)提供了樂觀的前景。

研究路線：

1. 數(shù)據(jù)庫分析和表達(dá)檢測：MEX3A在CRC組織中顯著上調(diào)；

2. RIP-seq和功能檢測：MEX3A通過抑制自噬來促進(jìn)CRC進(jìn)展；

3. 結(jié)構(gòu)分析和CoIP MS：MEX3A通過內(nèi)在無序區(qū)(IRDs)經(jīng)歷LLPS，并與MOV10、PABP1和UPF1相互作用形成PBs；

4. RIP和RNA Pull-down：circMPP6分別與MEX3A和PBs組分MOV10相互作用來促進(jìn)CRC；

5. CoIP和RIP：circMPP6通過影響MEX3A-PBs組分的協(xié)作來促進(jìn)PBs的維持；

6. RNA-Seq和RNA Pull-down：MEX3A/circMPP6招募了UPF1來啟動(dòng)自噬關(guān)鍵蛋白PDE5A mRNA的降解，促進(jìn)CRC發(fā)展。

研究結(jié)果：

1.    MEX3A在CRCs中高表達(dá)，促進(jìn)CRC細(xì)胞惡性并抑制自噬

Cbiopportal (http://www.cbioportal.org)分析發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)RBP“MEX3A”在人類CRC中顯著高表達(dá)(圖1a, b)。免疫組化(IHC)證實(shí)MEX3A在CRC組織中顯著上調(diào)(圖1c-e)，且與CRC臨床分期及T、N分期正相關(guān)，預(yù)示較差的患者總生存期(OS) (P < 0.05;圖1 f)。敲低或過表達(dá)MEX3的細(xì)胞和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MEX3A加重了CRC進(jìn)展。

為了尋找MEX3A的結(jié)合mRNA，作者在CRC細(xì)胞中進(jìn)行RIP-seq。KEGG pathway表明結(jié)合RNA主要富集于FoxO自噬相關(guān)通路，提示MEX3A可能與CRC細(xì)胞自噬有關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，在血清饑餓時(shí)，敲低MEX3A促進(jìn)了自噬（自噬活性標(biāo)志物LC3-II增加、自噬底物p62降解增加）；自噬溶酶體抑制劑氯喹(CQ)的處理阻斷了饑餓誘導(dǎo)的p62水平降低(圖1g)。mRFP-GFP-LC3自噬通量檢測顯示，敲低MEX3A導(dǎo)致CRC細(xì)胞中的自噬體和自溶體數(shù)量明顯增加(圖1i)，過表達(dá)結(jié)果與之相反。這些數(shù)據(jù)表明，MEX3A抑制自噬，從而促進(jìn)CRC進(jìn)展。

圖1

2.    MEX3A依賴內(nèi)在無序區(qū)形成PBs，且與PBs組分蛋白相互作用

IUPred2A工具(http://iupred2a.elte.hu)預(yù)測到MEX3A蛋白有幾個(gè)內(nèi)在無序區(qū)(IRDs) (圖2a)，可能導(dǎo)致相分離液滴的形成，因此構(gòu)建了MEX3A全長和兩個(gè)截短突變質(zhì)粒，分別在體外和體內(nèi)條件下驗(yàn)證此推論(圖2b)。體外條件下，全長MEX3A蛋白溶液在4°C時(shí)透明，隨溫度升高至37°C逐漸不透明(圖2c)。溶液中MEX3A和NaCl濃度的升高會(huì)增加微米級液滴的大小和數(shù)量(圖2d)。截短IDRs的液滴大小和數(shù)量顯著增加，刪除IDRs不能觀察到液滴(圖2c, d)。當(dāng)EGFP-MEX3A及其突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞后，EGFP-MEX3A在細(xì)胞質(zhì)中呈離散點(diǎn)狀分布，光漂白后熒光恢復(fù)(FRAP)實(shí)驗(yàn)觀察到液滴都在光漂白后6 min內(nèi)恢復(fù)了70%；EGFP-MEX3A-IDRs在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量液滴狀凝聚物，在光漂白后6 min內(nèi)恢復(fù)了90%；EGFP-MEX3A-IDRs△組僅有少量液滴，且在光漂白后無法恢復(fù) (圖2e-f)。此外，IDRs缺失還減弱了因MEX3A過表達(dá)導(dǎo)致的皮下腫瘤生長。這些結(jié)果表明，MEX3A的IDRs是其LLPS和促進(jìn)CRC腫瘤發(fā)生所必需的。

293T細(xì)胞的免疫共沉淀（Co-IP）和質(zhì)譜（LC-MS/MS）篩選了MEX3A的相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)了MOV10、UPF1、DDX6和PABP1等幾個(gè)PBs相關(guān)RBP (圖2g)。coip和免疫熒光(IF)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MEX3A與MOV10、PABP1和UPF1之間的結(jié)合(圖2h-i)，表明MEX3A蛋白是PBs的一個(gè)組成部分。

圖2

3.    PBs中的MEX3A與circMPP6結(jié)合

鑒于PBs是由關(guān)鍵蛋白和RNA的局部高濃度引起的，作者進(jìn)行了MEX3A蛋白的RIP實(shí)驗(yàn)和小RNA測序來篩選PBs穩(wěn)態(tài)相關(guān)的circRNA。結(jié)合CircInteractome工具(https://CircInteractome.nia.nih.gov/)對MEX3A和MOV10蛋白的結(jié)合circRNA的預(yù)測，選定circ_0001686（也叫circMPP6）做進(jìn)一步研究(圖3a)。Sanger測序驗(yàn)證了其反向剪接連接位點(diǎn)(圖3b)，F(xiàn)ISH表明circMPP6在細(xì)胞質(zhì)呈點(diǎn)狀分布(圖3c)。RIP和RNA Pull-down發(fā)現(xiàn)circMPP6與MEX3A和PBs核心成分MOV10相互作用(圖3d)。MEX3A、MOV10和circMPP6在胞質(zhì)共定位，并且嘌呤霉素(一種刺激PBs形成的藥物)的處理加速了circMPP6和MEX3A在細(xì)胞質(zhì)的富集(圖3f)。此外，過表達(dá)circMPP6大大增加了CRC細(xì)胞的增殖和遷移能力，其功能與MEX3A相似。這些結(jié)果表明circMPP6是MEX3A發(fā)揮作用的中間因子，MEX3A/circMPP6復(fù)合物的形成與CRC細(xì)胞中PBs的形成密切相關(guān)。

圖3

4.    circMPP6通過加強(qiáng)MEX3A-PBs組分的相互作用促進(jìn)PBs聚集

circMPP6如何調(diào)節(jié)MEX3A的功能呢？已知MEX3A參與泛素化，circRNAs也可以調(diào)節(jié)蛋白降解，但敲低circMPP6不影響MEX3A及PBs組分的蛋白水平。當(dāng)嘌呤霉素處理后，缺乏MEX3A/circMPP6可導(dǎo)致PBs解離，而細(xì)胞質(zhì)中存在MEX3A和circMPP6融合體(圖4a)，推測MEX3A/circMPP6復(fù)合物可能調(diào)節(jié)PBs的組裝。在sh-circMPP6-CRC細(xì)胞中進(jìn)行等量MEX3A蛋白的IP實(shí)驗(yàn)，MOV10、PABP1和UPF1的豐度都減少了。蔗糖梯度沉降實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：MOV10、PABP1和UPF1蛋白的分布相似(圖4b)，MEX3A的積累與受circMPP6調(diào)控的PBs蛋白組分有關(guān)。

為了鑒定MEX3A與circMPP6結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)架了MEX3A突變體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)MEX3A的KH1和KH2結(jié)構(gòu)域都與MEX3A/circMPP6復(fù)合物的形成有關(guān)(圖4c)，IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)MEX3A還通過KH2結(jié)構(gòu)域與3個(gè)PBs組分蛋白結(jié)合(圖4d)。作者進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)，敲低MEX3A引起的自噬促進(jìn)、轉(zhuǎn)移和增殖抑制可以被過表達(dá)野生型MEX3A(WT)所逆轉(zhuǎn)(圖4e-g)，但不能被過表達(dá)KH2缺失型MEX3A所逆轉(zhuǎn)，表明KH2結(jié)構(gòu)域在MEX3A介導(dǎo)的結(jié)直腸癌侵襲性中起關(guān)鍵作用。RIP-Seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，CACU RNA序列是MEX3A的結(jié)合基序，而circMPP6的接口序列中存在CACU基序。RNA Pull-down和RNA-EMSA實(shí)驗(yàn)都證明了circMPP6通過CACU基序與MEX3A結(jié)合。

這些結(jié)果都提示circMPP6通過影響MEX3A-PBs組分的協(xié)作來促進(jìn)PBs的維持。

圖4

5.    MEX3A/circMPP6復(fù)合物促進(jìn)PDE5A mRNA降解，調(diào)控CRC自噬

為了確定MEX3A的下游靶點(diǎn)，作者在對照和敲除MEX3A的CRC細(xì)胞中進(jìn)行RNA-Seq，并結(jié)合MEX3A的RIP-Seq數(shù)據(jù)，找到了29個(gè)共有差異mRNA (圖5a)；再參考TCGA患者和CRC細(xì)胞的失調(diào)基因，最終得到10個(gè)候選基因。qRT-PCR和Flag-MEX3A-RIP確定了PDE5A、SENP7和TTLL7 mRNA受到MEX3A的調(diào)控和結(jié)合(圖5b, c)。RNA Pull-down實(shí)驗(yàn)也顯示circMPP6與這三種mRNA相互作用(圖5d)。RIP-qPCR表明PBs組分MOV10和UPF1可以PDE5A mRNA結(jié)合 (圖5e)。此外，在敲低MEX3A/circMPP6后，CRC細(xì)胞中PDE5A、SENP7和TTLL7 mRNA的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)(圖5f)，表明MEX3A/circMPP6復(fù)合物介導(dǎo)的PBs聚集影響mRNA的降解。由于MEX3A抑制自噬進(jìn)程，因此PDE5A被確定為MEX3A的潛在靶點(diǎn)。

已知UPF1觸發(fā)PBs的mRNA降解，作者推測MEX3A/circMPP6復(fù)合體可能招募UPF1啟動(dòng)PDE5A mRNA降解。通過RIP-qPCR和IF-RNA FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MEX3A/circMPP6的敲低顯著降低了UPF1與PDE5A mRNA的結(jié)合，并且PDE5A mRNA的熒光強(qiáng)度增加(圖5g-h)，表明UPF1結(jié)合PDE5A mRNA并導(dǎo)致其降解的機(jī)制依賴于MEX3A/circMPP6復(fù)合體。

在敲低MEX3A的CRC細(xì)胞中再轉(zhuǎn)染PDE5A-shRNA時(shí)，明顯抑制了CRC的自噬(圖5i-k)，且促進(jìn)了增殖和轉(zhuǎn)移。異種移植模型也發(fā)現(xiàn)PDE5A的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了敲低MEX3A產(chǎn)生的腫瘤抑制作用(圖5I)，表明MEX3A在結(jié)直腸癌中的致癌作用依賴于PDE5A通路。

圖5

6.     MEX3A/circMPP6-PDE5A信號通路調(diào)控CRC發(fā)展

接下來，作者評估了MEX3A調(diào)控通路在結(jié)直腸癌患者中的臨床意義，在TCGA和SYSUCC數(shù)據(jù)集、以及8個(gè)匹配的CRC和鄰近非癌組織中，PDE5A的表達(dá)與MEX3A/circMPP6的水平呈負(fù)相關(guān)(圖6a-c)，并且高M(jìn)EX3A和低PDE5A的CRC患者的OS最差(圖6d)。這些結(jié)果證實(shí)MEX3A上調(diào)可顯著減弱PDE5A的表達(dá)，從而在結(jié)直腸癌侵襲性和患者預(yù)后中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖6

結(jié)論：

該論文揭示了RBP/circRNA復(fù)合物在調(diào)節(jié)PBs穩(wěn)態(tài)中的重要作用：circMPP6作為一個(gè)支架，介導(dǎo)了MEX3A與三種PBs相關(guān)蛋白（MOV10、PABP1和UPF1）的相互作用，促進(jìn)了CRC細(xì)胞中PBs的形成。MEX3A/circMPP6復(fù)合物可以影響PDE5A mRNA的降解，從而引發(fā)了CRC細(xì)胞的侵襲性。

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