人工環(huán)狀 RNA 可繞過細(xì)胞抗病毒反應(yīng)

發(fā)布時間：2022-05-11 09:50:10作者：輝駿生物-fitgene

研究人員在置換的內(nèi)含子-外顯子 (PIE) 系統(tǒng)中制造了人造環(huán)狀核糖核酸 (circRNA) 海綿，并表明這些海綿不會激活先天免疫。

研究背景

天然存在的circRNA是自然界中豐富的一類非編碼RNA，但其分子功能尚不清楚。當(dāng)作為 microRNA (miRNA) 海綿發(fā)揮作用時，circRNA 調(diào)節(jié)和中和內(nèi)源性 miRNA 水平。因此，研究者近年來對 circRNA 的研究對于醫(yī)學(xué)和藥物科學(xué)的發(fā)展變得越來越重要。

在他們之前的一項工作中，作者開發(fā)了一種體外生產(chǎn)和純化人工 circRNA 海綿 (ciRS) 作為 miRNA 抑制新劑的方法。使用丙型肝炎病毒 (HCV) 模型，他們證明人工 ciRS 能夠隔離成熟的 miRNA 以削弱其生物學(xué)功能。隨后，他們證明了 ciRS 可以靶向 miR-21，這是最早發(fā)現(xiàn)的致癌 miRNA 之一。對小動物的研究表明，人工 ciRS 如何隔離 miR-21 以抑制腫瘤生長。

總體而言，ciRS 已成為一種新的藥物，可抑制多種人類疾病中的 miRNA 活性，包括癌癥和病毒感染。

甚至基于信使 mRNA 的 2019 年冠狀病毒病 (COVID-19) 疫苗也使用體外轉(zhuǎn)錄的 RNA。因此，研究治療性 circRNA 在全身遞送時是否會觸發(fā)宿主細(xì)胞中的抗病毒反應(yīng)將是有趣的。值得注意的是，基于 mRNA 的 COVID-19 疫苗繞過了細(xì)胞免疫，從而獲得了臨床應(yīng)用的成功。

關(guān)于研究

在本研究中，研究人員用線性和環(huán)狀 miR-21 (liRS/ciRS-21-bu) 和對照 RNA (liRS/ciRS-21-rnd) 轉(zhuǎn)染 A549 細(xì)胞，然后通過 RNA 測序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析以鑒定免疫轉(zhuǎn)染后激活的信號通路。

為了提高體外生產(chǎn)的 circRNA 的純度，他們使用了聚丙烯酰胺凝膠純化方法。在純化過程中特定的聚丙烯酰胺濃度下，circRNA 在空間上與其他分子種類分離。他們還進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析 (DGEA) 以鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中差異表達(dá)的 mRNA。

該團(tuán)隊還創(chuàng)建了一個廣泛的雙鏈 circRNA (ciRS-21-ds)，其基本結(jié)構(gòu)與 ciRS-21-bu 和 ciRS-21-rnd 相同，但包含 50 個堿基對 (bp) 的隨機(jī)自互補序列。最后，研究人員使用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-qPCR) 評估了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中通過 RNA 測序鑒定的上調(diào)基因的 mRNA 水平。

研究結(jié)果

基因本體（GO）富集分析揭示了用 ciRS-21-bu 處理后幾個基因的上調(diào)。其中，6個基因與先天免疫反應(yīng)相關(guān)，包括趨化因子配體（CXCL）1、2、3和8，以及早期生長反應(yīng)1（EGR1）、白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶2（IRAK2）、和腫瘤壞死因子受體 (TNFR) 相關(guān)因子 1 (TRAF1)。

令人驚訝的是，ciRS-21-ds 還上調(diào)了蛋白激酶 R (PKR)，這是細(xì)胞免疫中的關(guān)鍵 RNA 傳感器，因此表明序列組成和廣泛的二級結(jié)構(gòu)元件可能在抗病毒防御的誘導(dǎo)中發(fā)揮作用。此外，DGEA 數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)染 ciRS/liRS-21-bu 或 ciRS/liRS-21-rnd 的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組非常相似。

ciRS-21-ds 在序列內(nèi)顯示出高度可信的堿基配對相互作用，最大長度為 50 bps，從而形成二級結(jié)構(gòu)。然而，體外生產(chǎn)效率較低并對轉(zhuǎn)錄效率產(chǎn)生不利影響，并改變了聚丙烯酰胺-尿素凝膠內(nèi)的流動性。

正如在 RT-qPCR 中觀察到的，少量 ciRS-21-ds 足以增加與先天免疫信號相關(guān)的 mRNA 水平。然而，轉(zhuǎn)染 ciRS-21-bu 的 A549 細(xì)胞需要更高劑量的 circRNA 才能將這些 mRNA 的上調(diào)降至最低。