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標(biāo)題：Circular RNA hsa-circ-0004872 inhibits gastric cancer progression via the miR-224/Smad4/ADAR1 successive regulatory circuit.

期刊：Molecular Cancer

影響因子：10.679

關(guān)鍵詞：circRNA，miRNA，miR-224，hsa-circ-0004872，p21，Smad4，ADAR1，胃癌

主要技術(shù)方法：circRNA測(cè)序，RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR），染色免疫共沉淀（ChIP-qPCR），雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠實(shí)驗(yàn)等。

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在癌癥致死率方面排名第三，由于復(fù)發(fā)率高和轉(zhuǎn)移，胃癌患者的預(yù)后很差。越來(lái)越多的研究表明，環(huán)狀RNA(CircRNA)在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用，探索胃癌中circRNA的表達(dá)情況和作用機(jī)制將有助于尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)提高胃癌患者的生存率至關(guān)重要。

2020年11月，山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)在胃癌中顯著下調(diào)的circRNA——hsa-circ-0004872，其表達(dá)水平與腫瘤大小和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。hsa-circ-0004872作為miR-224 的“分子海綿”來(lái)上調(diào)miR-224靶標(biāo)p21和Smad4的表達(dá)，其本身受到RNA編輯酶ADAR1的抑制，miR-224靶標(biāo)Smad4又可以結(jié)合ADAR1的啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)，從而正反饋調(diào)控hsa_circ_0004872的水平。該發(fā)現(xiàn)可能為胃癌的診斷和治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

1.    胃癌中低表達(dá)的hsa-circ-0004872可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移
研究者采用circRNA測(cè)序分析了胃癌和癌旁組織中的差異表達(dá)circRNA，并在42對(duì)臨床樣本中做了qPCR驗(yàn)證，最終選擇在胃癌組織中下調(diào)最顯著的hsa-circ-0004872作為研究目標(biāo)。Sanger測(cè)序、發(fā)散引物擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了胃癌中hsa-circ-0004872的存在，進(jìn)一步的臨床樣本分析表明，hsa-circ-0004872的表達(dá)水平與胃癌進(jìn)程和腫瘤大小有關(guān)。RNase R處理、Northern blot檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄抑制劑ActD處理實(shí)驗(yàn)確定了hsa_circ_0004872具有比線性RNA更好的穩(wěn)定性。EdU、CCK-8、傷口愈合和transwell等細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，hsa_circ_0004872可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，干擾hsa_circ_0004872后即有相反的效果。

2.    hsa-circ-0004872與miR-224相互作用
由于FISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004872定位于細(xì)胞質(zhì)中，因此推測(cè)它可能作為“miRNA海綿”發(fā)揮作用。AGO2抗體的RNA免疫共沉淀（RIP）可以富集到hsa_circ_0004872，表明其通過(guò)AGO2與miRNAs結(jié)合。接下來(lái)，數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了hsa_circ_0004872的潛在靶miRNAs，發(fā)現(xiàn)只有hsa-miR-224(miR-224)具有致癌功能。RNA pull-down和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)均表明hsa_circ_0004872與miR-224相互作用。

3.    hsa-circ-0004872通過(guò)miR-224上調(diào)其靶標(biāo)p21和Smad4的表達(dá)
過(guò)表達(dá)/干擾和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明miR-224促進(jìn)胃癌的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。為了確定miR-244在胃癌細(xì)胞中的靶基因，作者查找文獻(xiàn)并進(jìn)行了WB檢測(cè)和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，確定了其中2個(gè)靶基因“p21”和“Smad4”。之后檢測(cè)了hsa_circ_0004872對(duì)Smad4和p21表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004872的水平與胃癌細(xì)胞中的Smad4和p21蛋白水平呈正相關(guān)。功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，hsa_circ_0004872至少部分通過(guò)miR-224抑制GC的增殖、侵襲和遷移。

4.    hsa_circ_0004872抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
hsa_circ_0004872過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞通過(guò)皮下注射和尾靜脈注射的方式導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，hsa_circ_0004872過(guò)表達(dá)組形成的腫瘤平均體積遠(yuǎn)小于對(duì)照組，HE染色顯示所有腫瘤均為實(shí)體瘤，qRT-PCR分析表明，過(guò)表達(dá)組腫瘤中hsa_circ_0004872的水平高，而miR-224的水平低。IHC結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組腫瘤中p21和Smad4的表達(dá)增加；此外，過(guò)表達(dá)組小鼠肺表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯小于且少于對(duì)照組。說(shuō)明hsa_circ_0004872有效地抑制了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

5.    hsa_circ_0004872受RNA編輯酶ADAR1調(diào)節(jié)
circRNA的形成受到核糖核酸結(jié)合蛋白的調(diào)控，通過(guò)查找基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)只有RNA編輯酶ADAR1在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于非腫瘤組織，qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)果。數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，胃癌組織中ADAR1的高表達(dá)與生存期較短有關(guān)。ADAR1過(guò)表達(dá)/干擾實(shí)驗(yàn)確定了ADAR1蛋白對(duì)hsa_circ_0004872有抑制作用。功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，ADAR1干擾導(dǎo)致的miR-224下調(diào)被hsa_circ_0004872 siRNA部分逆轉(zhuǎn)，表明ADAR1通過(guò)hsa_circ_0004872調(diào)節(jié)miR-224的表達(dá)。

6.    Smad4通過(guò)ADAR1調(diào)節(jié)hsa_circ_0004872水平
由于miR-224的靶基因Smad4是一種轉(zhuǎn)錄因子，因此研究了其是否可以反饋調(diào)節(jié)ADAR1的水平。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ADAR1啟動(dòng)子區(qū)域存在Smad4結(jié)合位點(diǎn)，ChIP實(shí)驗(yàn)確定了Smad4可以直接與ADAR1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，Smad4過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了ADAR1蛋白和mRNA水平顯著下調(diào)，hsa_circ_0004872水平上調(diào)。雙熒光素酶也再次證明了Smad4過(guò)表達(dá)降低了ADAR1的啟動(dòng)子活性。