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背景：
骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種衰老或創(chuàng)傷相關(guān)的退行性關(guān)節(jié)疾病，其確切發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前尚無有效的疾病治療方法，迫切需要開發(fā)新的治療藥物。因此，了解控制軟骨細(xì)胞肥大和調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制對(duì)于開發(fā)有效的OA治療方法具有重要意義。

內(nèi)容概述：
2018年3月，輝駿生物合作伙伴，南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科器官衰竭研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在期刊Ann Rheum dis上發(fā)表了題為“Tyrosine kinase Fyn promotes osteoarthritis by activating the β-catenin pathway”的文章，深入探究了酪氨酸激酶Fyn在小鼠骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制。結(jié)果表明，F(xiàn)yn在人OA軟骨、老年小鼠軟骨和創(chuàng)傷后OA軟骨中的表達(dá)均明顯上調(diào)。Fyn聚集在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，與β-catenin的第142位酪氨酸（Tyr142）直接作用并使其磷酸化，穩(wěn)定β-catenin，促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位。Fyn基因的缺失有效延緩了小鼠創(chuàng)傷和年齡相關(guān)的OA發(fā)展。Fyn抑制劑AZD0530和PP1通過阻斷β-catenin途徑和降低關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝酶的水平而延緩OA的進(jìn)展。靶向Fyn或成為治療OA的一種新方法。

主要技術(shù)：
iTRAQ、CoIP MS、western blot，qPCR，基因過表達(dá)/干擾等；
輝駿生物為本研究提供了iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)和分析服務(wù)。

研究路線：

 
研究結(jié)果：
1. Fyn在老年小鼠、創(chuàng)傷后OA小鼠和人類OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中積累
研究者首先采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了年輕(2個(gè)月)和老年(12個(gè)月)小鼠關(guān)節(jié)軟骨中的差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶Fyn在老年軟骨強(qiáng)烈上調(diào) (圖1A)。通過Western blotting和免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果 (圖1B，C)，確定了Fyn的積累伴隨著老年小鼠軟骨的退化和OARSI分級(jí)的增加(圖1C，D)。之后又檢測(cè)了Fyn在手術(shù)誘導(dǎo)的創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎小鼠中Fyn水平隨著軟骨損傷的增加而顯著增加。在老年OA患者關(guān)節(jié)軟骨中，F(xiàn)yn水平明顯較高，同時(shí)軟骨結(jié)構(gòu)發(fā)生變性和丟失(圖1E，F(xiàn))。這些結(jié)果表明，Src激酶家族成員Fyn在老年小鼠的退化關(guān)節(jié)軟骨和OA患者的損傷關(guān)節(jié)軟骨中高水平表達(dá)。
 

2. Fyn基因缺失阻止小鼠創(chuàng)傷后和衰老相關(guān)OA的發(fā)生    
為了確定Fyn在退化或受損軟骨細(xì)胞中積累的生物學(xué)意義，研究者進(jìn)行了小鼠Fyn基因敲除實(shí)驗(yàn)(圖2A，B)。與對(duì)照組相比，基因敲除組（Fyn-KO）小鼠關(guān)節(jié)軟骨或生長板的形態(tài)和組織均沒有明顯差異，這表明Fyn基因的缺失沒有引起小鼠骨骼發(fā)育異常。與對(duì)照組相比，F(xiàn)yn-KO組小鼠的軟骨中蛋白質(zhì)含量顯著減少，TUNEL染色顯示Fyn-KO小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡明顯減少(圖2G)，軟骨降解程度有所降低。這些結(jié)果表明，F(xiàn)yn的缺失有效地阻止了小鼠創(chuàng)傷后OA和年齡依賴性O(shè)A的發(fā)展。

 

3. Fyn結(jié)合軟骨細(xì)胞中的β-catenin、磷酸化Tyr142并使其穩(wěn)定
為了探討Fyn促進(jìn)OA發(fā)展的機(jī)制，研究者采用CoIP-MS方法篩選軟骨前體細(xì)胞系A(chǔ)TDC5中的Fyn結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)β-catenin可能是Fyn的潛在互作蛋白(圖3A)。CoIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了兩者在ATDC5細(xì)胞(圖3B)、原代軟骨細(xì)胞和軟骨組織中存在相互作用。免疫熒光結(jié)果也顯示β-catenin與Fyn在ATDC5細(xì)胞中共定位(圖3C)。對(duì)軟骨細(xì)胞的體外Fyn激酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Fyn可使β-catenin發(fā)生Tyr142磷酸化，且該作用可被Fyn激酶抑制劑PP1或AZD0530所抑制（圖3D）。此外，當(dāng)Fyn被siRNA干擾后，β-catenin及其Tyr142磷酸化顯著下調(diào)，當(dāng)Fyn過表達(dá)時(shí)則相反 (圖3E,F)。為了驗(yàn)證Fyn在β-catenin信號(hào)通路中的作用，作者在ATDC5細(xì)胞中檢測(cè)了E-cadherin-catenin復(fù)合體的形成，發(fā)現(xiàn)Fyn被抑制時(shí)可以穩(wěn)定鈣粘連蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合體，而Fyn過表達(dá)則破壞了該復(fù)合體(圖3H)。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)yn結(jié)合β-catenin、磷酸化Tyr142并使其穩(wěn)定，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中E-cadherin-catenin復(fù)合體解離。

 
4. Fyn激活β-catenin通路促進(jìn)OA的發(fā)生
Fyn和β-catenin的免疫熒光結(jié)果顯示，隨著Fyn水平的增加，β-catenin從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核(圖4A)。用白介素1β(IL-1β)處理ATDC5細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其劑量依賴性地誘導(dǎo)Fyn和β-catenin在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中積聚(圖4B)，并上調(diào)Fyn蛋白及其磷酸化水平(Tyr416)、β-catenin蛋白及其磷酸化水平(Tyr142)，以及MMP13蛋白水平(圖4C)。接下來，研究者評(píng)估了老年小鼠和創(chuàng)傷后OA小鼠軟骨中β-catenin蛋白及其磷酸化水平。結(jié)果顯示，β-catenin及其磷酸化水平隨著年齡的增長和OA的加重而增加(圖4D)。此外，創(chuàng)傷后Fyn敲除小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的β-catenin水平及其核定位明顯低于對(duì)照組(圖4F)。WNT3a是典型的Wnt/β-catenin途徑的激活劑。Fyn敲除實(shí)驗(yàn)顯示，在OA發(fā)展過程中，F(xiàn)yn激活了不依賴Wnt信號(hào)的β-catenin通路，并增強(qiáng)了β-catenin在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)位。

作者接著研究了Fyn是否通過β-catenin通路促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。關(guān)節(jié)注射ICG-001（一種β-catenin/TCF 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制劑）明顯減少了軟骨損傷，維持了關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖的含量，并降低了OA發(fā)生過程中的關(guān)節(jié)炎分級(jí)，退化軟骨中MMP13和ADAMTS5的表達(dá)水平也相應(yīng)降低。這些結(jié)果表明，β-catenin通路參與了Fyn刺激軟骨細(xì)胞MMP13和ADAMTS5的表達(dá)以及小鼠OA的發(fā)生與發(fā)展。
 

5. Fyn抑制劑AZD0530和PP1抑制β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并阻止小鼠骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生
為了研究Fyn作為OA治療靶點(diǎn)的潛在用途，研究者采用Fyn化學(xué)抑制劑AZD0530和PP1處理小鼠并收集其關(guān)節(jié)，與對(duì)照小鼠相比，AZD0530和PP1處理顯著減少了軟骨破壞(圖5A)、OARSI分級(jí)(圖5B)和滑膜炎癥，MMP13、ADAMTS5和X膠原含量、TUNEL陽性軟骨細(xì)胞數(shù)和骨鈣素表達(dá)也顯著減少(圖5C，D)。這些結(jié)果表明，抑制Fyn激酶活性可以阻止小鼠創(chuàng)傷后OA的發(fā)生。Western blotting顯示AZD0530或PP1可阻斷IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上調(diào)，并抑制p-β-catenin(Tyr142)的增加（圖5E）。接下來，研究者檢測(cè)了用或不用AZD0530或PP1AZD0530或PP1治療的創(chuàng)傷后OA小鼠的軟骨樣本中p-β-catenin(Tyr142)的表達(dá)。結(jié)果顯示，AZD0530和PP1處理的小鼠，MMP13、p-FYN和p-β-catenin(Tyr142)的表達(dá)均明顯降低(圖5F)。此外，用AZD0530或PP1治療OA時(shí)，F(xiàn)yn和β-catenin在軟骨細(xì)胞核中也不再結(jié)合 (圖5G)。這些結(jié)果表明，AZD0530和PP1通過抑制FYN誘導(dǎo)的磷酸化β-catenin的表達(dá)來預(yù)防OA的發(fā)生。

 
結(jié)論：
本研究首次證明了SFK家族成員Fyn在軟骨退化和骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展中有重要作用：（1）發(fā)現(xiàn)Fyn在衰老小鼠、患有實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎的小鼠和骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨中積累。（2）發(fā)現(xiàn)Fyn結(jié)合β-catenin，磷酸化Tyr142和并增強(qiáng)其核轉(zhuǎn)位，這一作用在調(diào)節(jié)基質(zhì)降解酶的表達(dá)和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中起著重要作用。