內(nèi)容概述：

2022年3月，輝駿生物的合作伙伴——中山大學(xué)中山眼科中心團(tuán)隊(duì)在期刊Advanced Science（IF₂₀₂₀=16.806）上發(fā)表題為“MYPT1/PP1-Mediated EZH2 Dephosphorylation at S21 Promotes Epithelial-Mesenchymal Transition in Fibrosis through Control of Multiple Families of Genes “的文章。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2在晶狀體中高表達(dá)，AKT-EZH22通路在TGF-β誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中非常重要。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，MYPT1/PP1能使EZH2-S21去磷酸化。這些結(jié)果確定了EZH2-S21的特異性磷酸酶，并揭示了EZH22去磷酸化控制的、與晶狀體EMT和眼睛前囊下白內(nèi)障（ASC）發(fā)病相關(guān)的幾個(gè)基因家族。

主要技術(shù)：

shRNA慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建、免疫共沉淀（Co-IP）、蛋白質(zhì)譜檢測（LC-MS/MS）、CRISPR/Cas9；

輝駿生物為本研究提供了蛋白質(zhì)譜檢測和分析服務(wù)（LC-MS/MS）。

研究背景：

EZH2是多梳抑制復(fù)合物2(PRC2)中發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶活性的核心成員，可以催化H3K27Me3，進(jìn)而抑制下游基因轉(zhuǎn)錄。此外，EZH2還可以作為獨(dú)立于PRC2復(fù)合物的非組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，甲基化轉(zhuǎn)錄因子和其他靶標(biāo)。蛋白磷酸化在EZH2功能開關(guān)中起著重要作用。已知AKT激酶可以介導(dǎo)EZH2-S21磷酸化來抑制其H3K27Me3催化功能。然而，負(fù)責(zé)EZH2-S21去磷酸化的酶仍然未知。

研究路線：

研究結(jié)果：

1. EZH2在晶狀體上皮細(xì)胞中高表達(dá)且其活性和S21磷酸化水平隨EMT而增強(qiáng)

為了解EZH2在晶狀體中的作用，Western blot（WB）檢測了3周齡和成年小鼠晶狀體上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞中的EZH2和EZH2-S21磷酸化（p-EZH2 S21）水平，結(jié)果顯示：EZH2在3周齡和成年上皮細(xì)胞中均高表達(dá)，p-EZH2 S21在成年上皮細(xì)胞中的水平顯著高于3周齡小鼠，EZH2和p-EZH2 S21在成年纖維細(xì)胞中幾乎檢測不到（圖1A，B）。

正因?yàn)镋ZH2在小鼠晶狀體中高表達(dá)，因此推測其可能參與ASC上皮細(xì)胞的EMT進(jìn)程。對(duì)患者和小鼠模型的ASC斑塊進(jìn)行IF和WB分析，發(fā)現(xiàn)AKT活性和p-EZH2 S21水平顯著高于對(duì)照（圖1C-E）。低活性的EZH2（表現(xiàn)為較高的p-EZH2-S21和較低的H3K27me3）伴隨著為高水平的EMT標(biāo)記物（FN和α-SMA）（圖1E）。

圖1

2. TGF-β激活A(yù)KT-EZH2-H3K27Me3通路來介導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞中的EMT

為了確定AKT是否也能磷酸化EZH2-S21來調(diào)節(jié)晶狀體細(xì)胞的EMT，作者首先用TGF-β處理人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE 48小時(shí)，建立了EMT模型，接著用AKT活性抑制劑來封閉AKT的活性，這使得p-EZH2 S21減弱，H3K27Me3增強(qiáng)，并且消除了TGF-β誘導(dǎo)引起的EMT標(biāo)記物FN1和α-SMA的水平增加；AKT1和AKT2的敲低也得到了類似結(jié)果（圖2A-G）。這表明AKT能調(diào)控EZH2-S21磷酸化，介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞EMT。

圖2

3. MYPT1-PP1使EZH2-S21去磷酸化

那么是哪個(gè)蛋白酶去磷酸化EZH2-S21呢？作者利用OA（PP1和PP2A的有效抑制劑）處理HLE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)OA劑量依賴性的增加了p-EZH2 S21水平（圖3A-B）。免疫共沉淀質(zhì)譜（Co-IP MS）分析發(fā)現(xiàn)EZH2的結(jié)合蛋白除了有PRC2的其他組分SUZ12、EED和RBBP4之外，還有PP1調(diào)節(jié)亞基PPP1R12A（也稱為MYPT1），這引起了作者的注意。Co-IP WB和IF實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了EZH2和MYPT1間的相互作用（圖3C-F）。

圖3

4. MYPT1敲除增強(qiáng)了晶狀體上皮細(xì)胞EMT

為了證實(shí)MYPT1-PP1通過去磷酸化EZH2影響晶狀體上皮細(xì)胞的EMT進(jìn)程，作者采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除HLE細(xì)胞中的MYPT2，發(fā)現(xiàn)p-EZH2 S21增強(qiáng)，H3K27Me3水平下降（圖4A-C），并且TGF-β誘導(dǎo)的EMT顯著增強(qiáng)（圖4D-G）。MYPT2和EZH2沉默的斑馬魚突變體也表現(xiàn)出嚴(yán)重的心臟水腫、脊柱彎曲和小眼等表型，眼部組織中的EMT標(biāo)志物（FN1a, LAMC2和MMP9）也顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明，MYPT1-PP1可以使EZH2去磷酸化，激活其甲基轉(zhuǎn)移酶活性，并在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)EMT。

圖4

5. 內(nèi)源性EZH2-S21突變抑制了TGF-β誘導(dǎo)的EMT

為了進(jìn)一步確定EZH2-S21磷酸化能否從功能上控制EMT進(jìn)程，作者采用EZH2野生型和EZH2-S21突變型（絲氨酸突變成賴氨酸）慢病毒分別感染HLE細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（圖5A-C），WB和IF分析證實(shí)，相比于空載對(duì)照，它們的表達(dá)均顯著抑制了TGF-β誘導(dǎo)的EMT標(biāo)志物上調(diào)（圖5D-G）。

圖5

6. EZH2去磷酸化調(diào)控多個(gè)EMT相關(guān)的基因家族

為了找到EZH2去磷酸化調(diào)控的下游基因，作者對(duì)EZH2野生型、EZH2-S21突變型和空載對(duì)照細(xì)胞株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析, GO分析結(jié)果顯示很多差異基因?qū)儆诩?xì)胞外基質(zhì)基因和細(xì)胞粘附基因；之后又在敲除了內(nèi)源EZH2的細(xì)胞中再表達(dá)EZH2野生和EZH2-S21突變體，并用TGF-β處理。qPCR檢測了轉(zhuǎn)錄組篩選出的差異基因，確定了三個(gè)參與EMT調(diào)控的基因家族——膠原基因、細(xì)胞外基質(zhì)基因和細(xì)胞粘附基因（圖6A-D）。為了進(jìn)一步證實(shí)EZH2去磷酸化調(diào)控了這3個(gè)基因家族，選取了3個(gè)主要靶基因Col1A1、MMP17和POSTN進(jìn)行ChIP-seq，發(fā)現(xiàn)TGF-β處理的HLE細(xì)胞中的H3K27me3水平遠(yuǎn)小于未處理組（圖6E）。

圖6

7. EZH2-S21磷酸化調(diào)控POSTN基因來促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT和ASC

為了進(jìn)一步確定上述EMT相關(guān)基因家族確實(shí)受EZH2-S21去磷酸化控制并參與EMT和AGS病變，研究者利用慢病毒構(gòu)建EZH2沉默的HLE細(xì)胞系，再此基礎(chǔ)上分別進(jìn)行EZH2過表達(dá)、EZH2-S21A過表達(dá)和EZS2-S21D過表達(dá)（圖7A-C）。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)POSTN在EZS2-S21D細(xì)胞中的豐度最高（圖7D）。使用CRISPR/Cas9技術(shù)（圖7E）或shRNA（圖7F）敲除MYPT1可顯著增加POSTN mRNA水平，在MYPT1突變的斑馬魚眼睛中也觀察到POSTN的表達(dá)增強(qiáng)。

在POSTN沉默細(xì)胞中，TGF-β處理組的EMT標(biāo)記物（FN、COL1A1、SNAI1和SNAI2）水平均顯著低于非沉默細(xì)胞（圖7G-J）。在POSTN基因敲除小鼠中，ASC的誘導(dǎo)受到限制，EMT標(biāo)志物（FN、COL1A1）的表達(dá)也顯著降低（圖7K-M）。在患者ASC斑塊中，POSTN也高表達(dá)（圖7N）。

圖7

8. MYPT敲除促進(jìn)了EMT相關(guān)基因表達(dá)和AGS病變

為了進(jìn)一步確定EZH2-S21去磷酸化直接控制的EMT相關(guān)基因，研究者用TGF-β處理MYPT敲除細(xì)胞或未敲除細(xì)胞，qPCR方法檢測發(fā)現(xiàn)SPARC、BGN、PCDHB8、PCDHB16、COL1A1、COL4A1、COL4B2和COL7A1的水平顯著高于對(duì)照（圖8A）。在ASC小鼠模型（圖8B）和人類ASC患者（圖8C）中也得到了相似結(jié)果，表明這些由EZH2-S21去磷酸化控制的EMT相關(guān)基因顯著促進(jìn)了ASC病變。

圖8

研究結(jié)論：

該研究不僅確定了AKT激活EZH2-H3K27Me3來調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞EMT，而且發(fā)現(xiàn)了MYPT1-PP1可使EZH2-S21去磷酸化，進(jìn)而調(diào)控3個(gè)EMT相關(guān)基因家族參與ASC病變（圖8D）。