雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) * 技術(shù)原理
熒光素底物在熒光素酶作用下會(huì)發(fā)光，且光強(qiáng)度能反應(yīng)熒光素酶的蛋白表達(dá)量。而熒光素酶的蛋白表達(dá)量，又和啟動(dòng)子活性、mRNA的穩(wěn)定性及翻譯效率等有關(guān)。利用這個(gè)特點(diǎn)，將待測啟動(dòng)子、UTR等序列與熒光素酶ORF框融合表達(dá)，再檢測其發(fā)光強(qiáng)度，就能判斷這些序列對(duì)蛋白表達(dá)的影響。這就叫熒光素酶報(bào)告基因檢測。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，一般會(huì)同時(shí)轉(zhuǎn)染一個(gè)能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的質(zhì)粒作為內(nèi)參，所以叫雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。
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雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) * 技術(shù)流程
圖一：啟動(dòng)子活性分析示意圖
圖二：啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子互作分析示意圖
雙熒光素酶報(bào)告基因實(shí)驗(yàn) * 應(yīng)用背景
雙熒光素酶報(bào)告基因分析通常以螢火蟲熒光素酶為報(bào)告基因，以海腎熒光素酶為內(nèi)參基因。所構(gòu)成的報(bào)告系統(tǒng)具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍廣、應(yīng)用靈活等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控、非編碼RNA靶向互作等研究領(lǐng)域。
輝駿生物根據(jù)以下兩種應(yīng)用制定不同的實(shí)驗(yàn)方案，可針對(duì)客戶情況提出合適的建議>>
1. 檢測啟動(dòng)子活性；
2. 檢測轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)啟動(dòng)子的相互作用。
雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) * 服務(wù)信息
| 服務(wù)項(xiàng)目 | 服務(wù)內(nèi)容 | 結(jié)果交付 | 實(shí)驗(yàn)周期 | 客戶提供 | 價(jià)格 |
| 啟動(dòng)子活性分析 | 合成和構(gòu)建2kb啟動(dòng)子熒光素酶載體 | 載體質(zhì)粒、甘油菌 測序結(jié)果和實(shí)驗(yàn)報(bào)告 | 5-6周 | 待測細(xì)胞及其培養(yǎng)方法 實(shí)驗(yàn)信息表 |
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| 構(gòu)建不同截短啟動(dòng)子的熒光素酶載體 | 載體質(zhì)粒、甘油菌 測序結(jié)果和實(shí)驗(yàn)報(bào)告 |
| 細(xì)胞培養(yǎng)和雙熒光素酶檢測 | 檢測數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)報(bào)告 |
| 啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合驗(yàn)證 | 構(gòu)建野生型和突變型啟動(dòng)子的熒光素酶載體
| 載體質(zhì)粒、甘油菌 測序結(jié)果和實(shí)驗(yàn)報(bào)告 | 5-6周 | 待測細(xì)胞及其培養(yǎng)方法 轉(zhuǎn)錄因子基因質(zhì)粒模板及其原始測序文件 實(shí)驗(yàn)信息表 |
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構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體
| 載體質(zhì)粒、甘油菌 測序結(jié)果和實(shí)驗(yàn)報(bào)告 |
| 細(xì)胞培養(yǎng)和雙熒光素酶檢測 | 檢測數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)報(bào)告 |
雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) * 送樣要求
| 樣本類型 | 建議送樣量 |
| 目的基因模板 | 質(zhì)粒約2ug，或甘油菌約100ul |
| 待測細(xì)胞 | （廣州市內(nèi)客戶）可接受活細(xì)胞，2個(gè)T25瓶，細(xì)胞匯合度＞80%； （其他地區(qū)客戶）凍存細(xì)胞2管。 |
雙熒光素酶檢測啟動(dòng)子活性研究案例—客戶文章解析
Tang W.W. et al: The p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2 signalling axis regulates cell proliferation in human colorectal cancer.
Nature Communications. 2019, IF=12.121.
P300/YY1/miR-500A-5p/HDAC2信號(hào)軸調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌癌細(xì)胞增殖
研究概述
結(jié)直腸癌(CRC)是全球癌癥相關(guān)性死亡的主要原因之一，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高。闡明CRC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制將有助于尋找新的診斷生物標(biāo)志物和開發(fā)有效的治療干預(yù)措施。本研究發(fā)現(xiàn)miR-500a-5p在結(jié)直腸癌組織中下調(diào)，miR-500a-5p水平受到Y(jié)Y1/p300/HDAC2轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的協(xié)同調(diào)控。此外，miR-500a-5p還通過直接結(jié)合HDAC2的3’UTR來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移。
研究路線
細(xì)胞和臨床樣本分析顯示miR-500a-5p在CRC中低表達(dá)且與其惡行發(fā)展有關(guān)
熒光素酶等實(shí)驗(yàn)證明介導(dǎo)CRC細(xì)胞增殖的HDAC2是mR-500a-5p靶標(biāo)
熒光素酶和ChIP-qPCR等實(shí)驗(yàn)證明YY1可以結(jié)合miR-500a-5p啟動(dòng)子并負(fù)調(diào)控其表達(dá)
Co-IP、ChIP等實(shí)驗(yàn)表明miR-500a-5p水平還受到Y(jié)Y1/P300HDAC2復(fù)合體的調(diào)控
小鼠模型實(shí)驗(yàn)確定miR-500a-5p表達(dá)可顯著抑制胂瘤發(fā)展
分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
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